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上海哈靈生物科技有限公司
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總 RNA 樣品 mRNA 選擇純化試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟
2024-6-26 閱讀(108)
實(shí)驗(yàn)步驟詳細(xì)指南：
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
從-20℃冰箱中取出親和液(Reagent B)，置于冰槽內(nèi)融化，并搖勻。
預(yù)熱洗脫液(Reagent E)至65℃在恒溫水槽中。
實(shí)驗(yàn)流程：
一、RNA樣品準(zhǔn)備
從-70℃冰箱中取出總RNA樣品，解凍于冰槽內(nèi)。
準(zhǔn)確移取500微升(總量為0.5至1毫克總RNA)至新的1.5毫升離心管中。
二、RNA樣品處理
加入適量的平衡液(Reagent A)，渦旋震蕩5秒，確?；旌暇鶆颉?br />
瞬時(shí)離心15秒，去除氣泡。
將處理后的RNA溶液移入含有親和液(Reagent B)的離心管中。
再次渦旋震蕩5秒，確?；旌暇鶆颉?br />
室溫下，在平式搖蕩儀上以100RPM的速度孵育10分鐘。
瞬時(shí)離心15秒，去除上清液。
三、洗滌與純化
加入適量的高鹽液(Reagent C)，混勻后瞬時(shí)離心15秒，去除上清液。
重復(fù)上述洗滌步驟兩次。
加入適量的低鹽液(Reagent D)，混勻后瞬時(shí)離心15秒，去除上清液。
再次加入低鹽液(Reagent D)，混勻后轉(zhuǎn)移至離心柱中。
四、RNA洗脫與收集
瞬時(shí)離心15秒，更換收集管。
加入預(yù)熱至65℃的洗脫液(Reagent E)，室溫靜置1分鐘。
離心2分鐘，速度為16000g(例如使用eppendorf 5415離心機(jī)時(shí)，轉(zhuǎn)速為13000RPM)。
重復(fù)上述洗脫步驟一次。
五、RNA沉淀與干燥
丟棄離心柱，加入濃縮液(Reagent F)和沉淀液(Reagent G)，混勻。
可選擇性地放入-70℃冰箱中孵育10分鐘。
離心15分鐘，速度為16000g，去除上清液。
加入凈化液(Reagent H)，4℃離心5分鐘，去除上清液。
在空氣中晾干RNA樣品。
六、RNA保存與濃度測定
加入適量的保存液(Reagent I)，溶解RNA。
將RNA樣品放入-70℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br />
七、mRNA濃度測定(可選)
移取1微升mRNA樣品至1.5毫升離心管中。
加入適量的保存液(Reagent I)，混勻。
將混合液移入100微升規(guī)格的石英比色杯中。
使用分光光度儀，在260nm波長下測定OD值。
根據(jù)公式：濃度(微克/微升)=OD260 X 4，計(jì)算mRNA的濃度。
注意事項(xiàng)：
所有操作均需在冰上進(jìn)行，以保持RNA的穩(wěn)定性。
使用前請確保所有試劑均已搖勻，并避免交叉污染。
離心過程中請確保離心管平衡，避免損壞離心機(jī)。
洗滌和純化步驟是確保RNA純度和質(zhì)量的關(guān)鍵，請務(wù)必按照步驟操作。
測定mRNA濃度時(shí)，請確保分光光度儀已校準(zhǔn)，并選擇合適的波長。
以上內(nèi)容僅供參考，具體以紙質(zhì)版說明書為準(zhǔn)
