喹諾酮（QNS）定量檢測試劑盒（ELISA）
使用說明書
一、概要
喹諾酮（QNS）是近20年來迅速發(fā)展起來的一類十分重要的廣譜抗生素，能抑制細(xì)菌DNA螺旋酶，抗菌譜廣、、低毒、組織穿透力強(qiáng)。已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中zui重要的抗感染藥物之一，被大量用于治療、預(yù)防和促生長，由于其耐藥性和潛在的致癌性引起廣泛的關(guān)注。
酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒具有成本低廉、操作簡便、一次處理樣本量大等優(yōu)點(diǎn)，已成為常規(guī)的初步篩查方法。本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，能zui大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
二、用途
定量檢測動物組織 （肌肉、蝦、魚等）、血清和蜂蜜等樣本中喹諾酮（QNS）的殘留。
三、檢測原理
本試劑盒采用競爭酶聯(lián)免疫試驗(yàn)。檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，微孔板預(yù)包被羊抗鼠IgG捕獲抗體，加入鼠抗喹諾酮抗體后，會與捕獲抗體連接。經(jīng)過孵育及洗板后，加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及喹諾酮酶標(biāo)記物（QNS-HRP），游離的喹諾酮（QNS）與喹諾酮酶標(biāo)記物（QNS -HRP）競爭喹諾酮抗體結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)過孵育及洗板后，加入底物并孵育。結(jié)合的酶連接物將底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450 nm 處測量，吸光度值與樣品中的喹諾酮濃度成反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣品中喹諾酮的含量。
四、檢測限
檢測限：0.1ng/ml（0.1ppb）
五、特異性
*………………………………………………*
*………………………………………………96.6%
*………………………………………………112.3%
達(dá)氟沙星………………………………………………98%
*……………………………………………… 134%
噁喹酸 ………………………………………………105.3%
氟甲喹 …………………………………………………96.1%
麻保沙星………………………………………………92.3%
氨氟沙星………………………………………………110%
*…………………………………………… 87.7%
培氟沙星……………………………………………129.6%
*……………………………………………100.7%
六、試劑盒組成
每一個盒中的試劑足夠進(jìn)行 96 個試驗(yàn)（包括標(biāo)準(zhǔn)測定），試劑盒中的組份如下：
1、96孔酶標(biāo)板1塊（12孔×8條）：預(yù)包被羊抗鼠IgG
2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶（1ml/瓶）：
0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL
3、酶標(biāo)記物（6mL）：辣根過氧化物酶標(biāo)記的喹諾酮工作液
4、喹諾酮抗體（10mL）：鼠抗喹諾酮單克隆抗體工作液
5、底物液A（6mL）：過氧化脲
6、底物液B（6mL）：四甲基聯(lián)苯胺（TMB）
7、終止液（6mL）：2N H2SO4
8、濃縮洗滌液（20×）（25mL）：含Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）
9、其他：封板膜3張，自封袋1個，說明書1份
七、樣本處理
1、溶液配制
配液1：8%甲醇-水溶液
量取8ml甲醇加入到92ml去離子水中混勻。
配液2：0.05M磷酸鹽緩沖液（PH＝7.2）
稱取12.9g十二水合*和2.18g二水合*，加去離離子水溶解定容至1L。
配液3：洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液4：復(fù)溶工作液
用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1：1體積比進(jìn)行稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
2、樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（c）未處理的樣本冷凍保存。
3、蜂蜜前處理方法
方法一：
┅┅取1.0±0.05g 蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml 8%甲醇-水溶液（見配液1），用渦旋儀渦動5min，使其充分溶解；
┅┅靜止10min；
┅┅取100ml加入300ml復(fù)溶工作液， 用渦旋儀渦動混勻；
┅┅取50ml用于分析。
注：稱取蜂蜜樣本之前請于60℃水浴30-60min，振蕩樣本充分混勻后再取樣。
方法二：
----取1.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入2ml0.05M磷酸鹽緩沖液（見配液2），用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；
----加入8ml二氯甲烷，用振蕩器振蕩5min,3000g以上離心5min；
----輕吸掉上層，取下層有機(jī)相4ml至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?/span>
----用1ml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物；
-----取50ml用于分析。
八、檢測步驟
仔細(xì)的洗滌非常重要。避免在操作過程中微孔出現(xiàn)干燥。
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上。
2、準(zhǔn)備：取出需要數(shù)量的微孔板，將用剩的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。將微孔板條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。
3、加抗體：每孔加入100μL抗體溶液，37℃恒溫箱孵育30分鐘。
4、洗板：倒出孔中的液體，將微孔架倒置在干凈吸水紙上拍打，以保證*除去孔中的液體。每孔加滿稀釋后的洗滌工作液，靜置20秒鐘，甩去液體，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品：加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實(shí)驗(yàn)，然后加入50μL酶標(biāo)記物到微孔，小心地充分混合，37℃恒溫箱孵育30分鐘。
6、重復(fù)3的操作。
7、顯色：每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，37℃避光孵育15min（如果顯色過淺，可適當(dāng)延長孵育時間，反之亦然）。
8、測定：每孔加入終止液50μL，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測定每孔OD值。
九、結(jié)果判定
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以*，即
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克侖特羅的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?/span>
十、注意事項(xiàng)
1、嚴(yán)格按照說明書操作時間，每加一種試劑前需要將其搖勻，各操作步驟緊湊進(jìn)行。
2、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
3、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
4、試劑變質(zhì)的跡象
底物有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到25min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時間。
7、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
十一、貯存條件及有效期
貯存條件：2-8℃、干燥避光防潮。
有效期：在正確貯存條件下，有效期為12個月。
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