特點(diǎn)

液相色譜法有“四高一廣”的特點(diǎn)：

①高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。
②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。
③：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以達(dá)到分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。
④高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級。
⑤應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。
⑥柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物
⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
此外液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充。液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

類型

1．吸附色譜法(Adsorption Chromatography)
2．分配色譜法(Partition Chromatography)
3．離子色譜法(Ion Chromatography)
4．分子排阻色譜法/凝膠色譜法(Size Exclusion Chromatography)
5．鍵合相色譜法（bonded-phase chromatography）
6．親和色譜法(Affinity Chromatography)

結(jié)構(gòu)

組成
可分為“高壓輸液泵”、“色譜柱”、“進(jìn)樣器”、“檢測器”、“餾分收集器”以及“數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)”等部分。
技術(shù)動態(tài)
液相色譜和質(zhì)譜連接，可以增加額外的分析能力，能夠準(zhǔn)確鑒定和定量像細(xì)胞和組織裂解液，血液，血漿，尿液和口腔液等復(fù)雜樣品基質(zhì)中的微量化合物。液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)（ABSciex Eksigent LC / MS和LC / MS / MS）提供了一些*的優(yōu)勢，包括：

    快速分析和流轉(zhuǎn)所需的zui少樣品準(zhǔn)備
    高靈敏度并結(jié)合可分析多個(gè)化合物能力，甚至可以跨越化合物的種類
    高度，高分辨率鑒定和量化目標(biāo)分析物

高壓輸液泵
功能
驅(qū)動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng)；
性能要求
流量穩(wěn)定（±1)，耐高壓(30～60Mpa)，耐各種流動相：例如：有機(jī)溶劑、水和緩沖液；
種類
往復(fù)泵和隔膜泵。

色譜柱
功能
分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)；
尺寸
10～30cm長，2～5mm內(nèi)徑的內(nèi)壁拋光的不銹鋼管柱；
填料粒度
5 ～10μm ，微粒固定相；

進(jìn)樣器
功能
將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)；
種類
①注射器，10Mpa以下，1～10μm微量注射器進(jìn)樣
②停流進(jìn)樣
③閥進(jìn)樣，常用、較理想、體積可變，可固定
④自動進(jìn)樣器，有利于重復(fù)操作，實(shí)現(xiàn)自動化

檢測器
功能
將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號；
分類
①示差折光化學(xué)檢測器
②紫外吸收檢測器
③紫外-可見分光光度檢測器
④二極管陣列紫外檢測器
⑤熒光檢測器
⑥電化學(xué)檢測器

餾分收集器
功能
如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的；
方法
①手工，少數(shù)幾個(gè)餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯(cuò)。
②餾分收集器收集，比較理想，微機(jī)控制操作準(zhǔn)確。
數(shù)據(jù)
獲取與處理功能
把檢測器檢測到的信號顯示出來。

色譜柱

填料和流動相的組分
應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠zui為常用辛基鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。
在用紫外吸收檢測器時(shí)，所用流動相應(yīng)符合紫外分光光度法項(xiàng)下對溶劑的要求。
正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn)

樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變。
以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。
系統(tǒng)適用性
按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的zui小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子.
色譜柱
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖

，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的zui小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。
分離度
定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計(jì)算公式為：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)， 式中 t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另外有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為：
T(拖尾因子)=W0.05h/2d1式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬；
d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外,T應(yīng)在0.95～1.05間。
也可按各品種校正因子測定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。

測定

定量測定時(shí)，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標(biāo)法測定雜質(zhì)總量時(shí)，須采用峰面積法。
面積歸一化法
測定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。色譜圖的記錄時(shí)間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時(shí)間決定，除另有規(guī)定外可為該品種項(xiàng)下主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。
主成分自身對照法
當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時(shí)，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或進(jìn)樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準(zhǔn)確測量要求。然后取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。根據(jù)測得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)限度。
內(nèi)標(biāo)法 測定供試品中雜質(zhì)的總量限度
采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖Ⅰ；再配制含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖Ⅱ。記錄的時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為該品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰高應(yīng)為記錄儀滿標(biāo)度的30%以上，否則應(yīng)調(diào)整注樣量或檢測器靈敏度。
如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，則色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積（溶劑峰不計(jì)在內(nèi)）。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，應(yīng)將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。
加校正因子測定供試品主成分含量
按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：
As/ms]校正因子f=- Ar/mr 式中 As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高,Ar為對照品的峰面積或峰高； ms為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量mr為加入對照品的量。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質(zhì)）峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：Ax 含量(mx)=f×-As/ms 式中 Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高； mx為供試品（或其雜質(zhì)）的量。f、As和ms的意義同上。
當(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一分內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。
外標(biāo)法 測定供試品中含量
按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：
A<[x]> 含量(mx)=mr×-Ar式中各符號意義同上
由于微量注射器不易控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時(shí)，以定量環(huán)進(jìn)樣為好。
綜述
要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。
相對分子質(zhì)量
對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對分子質(zhì)量在200 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。
溶解度
水溶性樣品用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。
化學(xué)結(jié)構(gòu)
若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。