引發(fā)適應(yīng)過程中 spacer 的尋取和定點(diǎn)整合機(jī)制示意圖

科研試劑廠家-齊一生物

CRISPRs-Cas 系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古菌中的適應(yīng)性核酸免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有豐富多樣的功能組分和核酸處理機(jī)制，為人類提供了迄今zui的基因組編輯技術(shù)（如 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)）和基因檢測技術(shù)（如 CRISPR-C2c2/Cas13a 系統(tǒng)），同時(shí)也為理解生命的進(jìn)化與適應(yīng)機(jī)制提供了前沿窗口。中國科學(xué)院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室向華研究組是我國較早從事 CRISPR-Cas 系統(tǒng)基礎(chǔ)研究的團(tuán)隊(duì)，面對上缺乏 CRISPR 從純病毒獲取 spacer 的適應(yīng)系統(tǒng)的困境，于 2014 年在古菌中建立了*（所有系統(tǒng)中第二個(gè)）CRISPR-Cas 系統(tǒng)對純病毒的適應(yīng)體系，揭示了嗜鹽古菌 I - B 型 CRISPR 適應(yīng)需要“引發(fā)”的本質(zhì)，提出了引發(fā)適應(yīng)可能是 CRISPR 系統(tǒng)在自然界對病毒發(fā)生適應(yīng)的主要模式這一重要論斷；并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)除性外，引發(fā)適應(yīng)還通過巧妙的 PAM 驗(yàn)證實(shí)現(xiàn)了嚴(yán)格的異己區(qū)分和的防病毒逃逸機(jī)制，回答了困擾科學(xué)家多年的 CRISPR 適應(yīng)過程的性及異己區(qū)分難題（Nucleic Acids Res., 2014，42：2483–2492；Nucleic Acids Res., 2014，42：7226–7235）。相關(guān)工作作為 CRISPR 適應(yīng)領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)已被 Nature, Cell,Science, PNAS 等引用 80 余次。zui近，向華研究組通過對該 CRISPR 系統(tǒng)的人工改建，又在 CRISPR 適應(yīng)過程中 spacer 的長度決定和定點(diǎn)整合的位點(diǎn)識(shí)別機(jī)制方面連續(xù)取得了新的進(jìn)展（Nucleic Acids Res., 2016，44：4266–4277；Nucleic Acids Res., 2017，45 : 4642-4654）。

CRISPR 適應(yīng)過程中，spacer 整合反應(yīng)往往發(fā)生于 CRISPR 結(jié)構(gòu)的 leader 端且與其緊鄰的 repeat 將發(fā)生復(fù)制。以來，上普遍認(rèn)為整合復(fù)合物先識(shí)別 repeat 的一端，再通過嚴(yán)格的分子尺機(jī)制識(shí)別另一端，從而確定新復(fù)制 repeat 的尺寸和序列。但有意思的是，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)傾向于先識(shí)別序列保守的“repeat 近 leader”端，而另外有實(shí)驗(yàn)室則認(rèn)為是先識(shí)別“repeat 遠(yuǎn) leader”端。向華研究組巧妙設(shè)計(jì)了一個(gè)引發(fā) - 整合相分離的 CRISPR 適應(yīng)系統(tǒng)，通過系統(tǒng)的掃描突變鑒定了 repeat 內(nèi)部兩個(gè)關(guān)鍵的整合識(shí)別元件。其中，元件 1（AACCC）嚴(yán)格位于“近 leader”端整合位點(diǎn)的下游 10 bp 處，而“遠(yuǎn) leader”端整合反應(yīng)嚴(yán)格地發(fā)生于元件 2（GTGGG）下游約 10 bp 處。上述兩元件為 repeat 識(shí)別所必需，且其間距的增減可在一定范圍內(nèi)相應(yīng)增減 repeat 的固有尺寸，這說明在 spacer 整合過程中并不存在 repeat 長度的分子尺機(jī)制，而是整合復(fù)合物先識(shí)別近 leader 的 repeat 的內(nèi)部關(guān)鍵元件，并通過 10-bp 左右的分子尺識(shí)別兩端的整合反應(yīng)位點(diǎn)（Nucleic Acids Res., 2016，44：4266–4277）。有意思的是，這一重要發(fā)現(xiàn)發(fā)表不久，很快得到了上其他團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，說明了該機(jī)制在不同 CRISPR 系統(tǒng)中具有普遍性。

關(guān)于 spacer 長度決定機(jī)制，2016 年上兩家重要實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)解析了大腸桿菌 spacer 獲取機(jī)器（Cas1-Cas2 復(fù)合物）在底物結(jié)合狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)性限制提供了一個(gè)固定的分子尺，并界定了 spacer 的長度。但令人費(fèi)解的是，在其它大多數(shù)的 CRISPR 系統(tǒng)中，spacer 長度并非固定不變，而是具有一定的尺寸多態(tài)性。向華研究組進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一個(gè) CRISPR 單一引發(fā)的適應(yīng)系統(tǒng)，利用高通量測序技術(shù)，分析了近 4 萬個(gè)新 spacer 的獲取過程，發(fā)現(xiàn)與自然界已有的數(shù)據(jù)一樣，這些 spacer 的尺寸并非固定不變，而是在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)正態(tài)分布。有意思的是，他們通過生物信息學(xué)分析檢測到在 spacer 倒數(shù)第三個(gè)堿基位點(diǎn)上的胞嘧啶（C）偏好性，對相應(yīng)位點(diǎn)的突變則可改變獲取 spacer 的尺寸。該高通量數(shù)據(jù)結(jié)合分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn) spacer 獲取機(jī)器不僅識(shí)別 protospacer 5’一側(cè)的 PAM 序列，而且識(shí)別 protospacer 3’端的部分序列，這一序列特異性識(shí)別可對獲取機(jī)器的分子尺機(jī)制進(jìn)行微調(diào)，從而導(dǎo)致了 spacer 尺寸的多態(tài)性。該 spacer 獲取的大數(shù)據(jù)分析工作，還觀測到了適應(yīng)機(jī)器在病毒模板上的滑脫（slip）和在整合過程中的翻轉(zhuǎn)（flip）現(xiàn)象，并進(jìn)一步證明了引發(fā)適應(yīng)過程中雙向?qū)と?spacer 的滑動(dòng)（sliding）假說（Nucleic Acids Res., 2017，45 : 4642-4654）。

上述進(jìn)展為系統(tǒng)理解 CRISPR 引發(fā)適應(yīng)過程（靶向引發(fā)，雙向?qū)と?，定點(diǎn)整合）的性與特異性提供了新的依據(jù)（圖 1），也為未來開發(fā)基于 CRISPR 精妙的適應(yīng)過程的分子生物學(xué)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。