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SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白大小、純度及濃度
點擊次數(shù)：1367 發(fā)布時間：2018-3-19
一、原理
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（Acrylamide簡稱Acr）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（N，Nˊ-MethyleneBisacrylamide,簡稱Bis）,在催化劑核黃素或過硫酸銨和四甲基乙二胺的催化下，聚和而成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠。
正常情況下蛋白的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。而在丙烯酰胺凝膠中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS)，則蛋白的遷移率主要取決于蛋白大小，與所帶電荷與形狀無關(guān)。因此可以利用SDS-PAGE對蛋白質(zhì)分子量與純度進行鑒定以及濃度的檢測。
二、試劑
1、A溶液：1.5M Tris（三氨基甲烷），0.4%SDS，pH8.8。
2、B溶液：0.5M Tris.Cl，0.4%SDS，pH6.8。
3、5×ESB（加樣緩沖液）。
4、染色液：0.25%的考馬斯亮藍R 250、40%的甲醇、10%的乙酸。
5、脫色液：40%的甲醇、10%的乙酸。
6、10×Laemmle-buffer（電極緩沖液）：250mMTris、1920mM*、1%SDS。
7、10%過硫酸銨（APS）
8、異丙醇
9、四甲基乙二胺（TEMED）
三、制膠
根據(jù)蛋白樣品的大小制不同濃度的膠，蛋白分子量小就要制高濃度的膠，分子量大的蛋白就制低濃度的膠，制不同厚度的膠所需的濃縮膠和分離膠體積也不一樣。
5%濃縮膠：
30%Acr-Bis 1ml、A溶液1.5ml、無菌水3.5 ml、APS 75ul、TEMED 10ul。
12.5%分離膠：
30%Acr-Bis 5 ml、B溶液3 ml、無菌水3.9 ml、APS 150ul、TEMED 10ul。
四、加樣、電泳
過稍許時間等膠凝固后把蛋白marker和所需的鑒定的蛋白和標準品蛋白（如BSA）經(jīng)處理后加到加樣孔中，倒入電泳緩沖液接通電源開始跑膠。
五、染色、脫色
等示蹤染料溴酚藍跑至膠末端，關(guān)閉電源，去除濃縮膠后，將分離膠放入考馬斯亮藍染色液中染色40分鐘，然后放入脫色液中脫色1小時，并換脫色液2-3次。
六、蛋白大小、純度的鑒定及濃度的檢測
根據(jù)Marker（或者蛋白標準品的相對遷移率制作的標準曲線）判斷蛋白大小，根據(jù)有無雜帶判定蛋白的純度。根據(jù)BSA標準品條帶的灰度制作標曲，并計算出目的蛋白的相應(yīng)濃度。
七、注意事項
1、 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），如果比例不當，就不能得到準確的數(shù)據(jù)。
2、 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標準曲線。不能利用這次的標準曲線作為下次用。
3、 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-*）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。
4、 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對分子量。
5、 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。
八、節(jié)省時間小竅門
正常情況下膠跑完之后要染色脫色3-4個小時之后才能看到結(jié)果，如果我們把染色液加熱一下染色這樣就會加快染色，或者是把染色中考馬斯亮藍R 250加倍10-20分鐘就可以。脫色的時候我們可以不用脫色液，直接在水中煮沸10分鐘就能看到結(jié)果，如果不夠清楚，可以換水再煮10分鐘。