平時在ELISA試劑盒實驗室zui常聽到的一句話就是“今天某某試驗沒做好是為什么？今天某某試驗沒出結(jié)果是什么原因？今天某某試驗為什么會是這樣的呢？" 等等。然后仔細(xì)一查找原因，往往是由于操作上面的不認(rèn)真，或是一些小小的細(xì)節(jié)沒有注意到。以下是集各路朋友的一些經(jīng)驗，與大家分享：
1跑page膠的時候，小電壓跑會避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會比大電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。
2. 提取質(zhì)粒的時候，zui后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長一點時間，是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是37度溫箱放長一點的時間，我試過室溫過夜，酶切很好。
3. 做WESTERN BLOT 的時候，大家往往會摸索一抗、二抗的濃度，封閉時間，曝光時間等等，而每次變換其中的一個條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會浪費大量的時間。其實*沒有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時候取出一塊，沒有任何影響。這對于摸索條件的戰(zhàn)友來說，節(jié)約了大量的時間。
4. 有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置
1）將緩沖液配方中的成分分別以10－100倍配成母液儲存，需要的時候只需將相應(yīng)的母液混合，補加水稀釋即可
2）配培養(yǎng)基時通常會忘記各成分的量，如配LB時的三個成分不記得到底哪個是5g，哪個要10個，因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量，如配LB時，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前臨時翻書
5. 有關(guān)PCR主反應(yīng)液配置:

在做克隆鑒定的時候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進行PCR鑒定，每次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液（100次反應(yīng)），其中含buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分裝或一管儲存在－20度，在需要的時候拿出融開，然后按所需的PCR反應(yīng)個數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：
1）可極大的節(jié)省寶貴的時間，可早點收工，看球
2）避免每次反應(yīng)加樣不均的可能
3）大大減少PCR假陽性的產(chǎn)生
6. 有關(guān)酶切反應(yīng)液的配置:
在做酶切時，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時有10幾個陽性克隆需要鑒定時尤為明顯：
1）各反應(yīng)成分均一
2）可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用
3）節(jié)省時間

ELISA試劑盒技術(shù)的特點
可擴增RNA或cDNA
先按通常方法用寡脫氧核苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)錄成主鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增。即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有cDNA中的0．01％，也能經(jīng)PCR擴增出10倍242bp對長度的特異性片段。有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難于將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作為模板，則可將外顯子集中，用PCRl次便完成對外顯子的擴增并進行序列分析。

特異性強
自從提取出耐熱TaqDNA聚合酶以來，在熱變性處理時不被消化、不必在每次循環(huán)擴增中再加入新酶，以及在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著提高了PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。PCR擴增的特異性還依賴于兩個引物設(shè)計的好壞，依賴于引物與模板結(jié)合的正確性。PCR反應(yīng)時退火溫度對特異性也有影響，一般來說，退火溫度越高，擴增的特異性越好。高溫啟動法也可增加PCR擴增的特異性，即通過在高溫（70℃）下加入某些必需因子（DNA聚合酶、模板DNA、Mg2+或引物等），使TaqDNA聚合酶僅在反應(yīng)達到較高溫度（>70℃）時才發(fā)揮作用。其他因素如酶濃度、dNTP、Mg2+、pH值等對PCR的特異性也有一定的影響。

敏感性高
如前所述，PCR產(chǎn)物的生成以指數(shù)方式增加，能將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。這是PCR技術(shù)zui主要的特點，它可對單拷貝基因、單個細(xì)胞、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進行分析。

有一定程度單核苷酸錯誤摻入
TaqDNA聚合酶缺少3’-5’核酸外切酶活性，因而不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的核苷酸錯誤摻人；與大腸桿菌聚合酶I Klenow片段相比較，用TaqDNA聚合酶的反應(yīng)錯誤摻人相對多些。但在PCR擴增過程中，其錯配率一般只有約1／萬，足可以供特異性分析。

操作簡便、快速
目前國內(nèi)外已有多種類型的PCR擴增儀，只需把反應(yīng)材料按一定濃度混合，置于儀器內(nèi)，反應(yīng)便按所輸入的程序進行。整個PCR操作過程，從標(biāo)本處理、PCR擴增到產(chǎn)物分析，可在4h內(nèi)完成全部實驗。擴增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因分析方法；可直接從總RNA或DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去須先進行克隆后再作序列分析的模式。已固定和包埋的組織或切片亦可用于檢測。