1 配液：ELISA試劑盒將50ml濃縮洗刷液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋至1000ml備用。

2 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板設(shè)陰性對(duì)照3孔、陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ型、Ⅱ型各1孔，空白對(duì)照1孔。

3 加樣：分別在相應(yīng)孔加入待檢標(biāo)本、陰性、陽(yáng)性對(duì)照100μl，用封板膜封板后置37℃溫育30min。

4 洗刷：當(dāng)心把封板膜揭去，用洗板機(jī)挑選5次程序，洗板后拍干。 

5 加酶：每孔加酶結(jié)合物100μl（空白對(duì)照孔除外），充沛混勻，用封板膜封板后置37℃溫育30min。

6 洗刷：當(dāng)心把封板膜揭去，用洗板機(jī)挑選5次程序，洗板后拍干。

7 顯色：每孔加入顯色劑A液和B液各50μl，悄悄振動(dòng)混勻，封板后置37℃避光顯色15min。

8 測(cè)定：每孔加終止液50μl，悄悄振動(dòng)混勻。設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450nm（建議使用雙波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀比色，參閱波長(zhǎng)630 nm），空白調(diào)零，讀取各孔OD值。

9 判斷成果：核算臨界值（cut-off）（CO）值。 臨界值＝陰性對(duì)照A均值＋0.12 正常情況下，陰性對(duì)照孔的OD值≤0.10（若1孔陰性對(duì)照的OD值＞0.1應(yīng)放棄，若有2孔或2孔以上陰性對(duì)照的OD值＞0.1，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。）。樣品OD值＜臨界值者為HIV抗體陰性。

正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔的OD值≥0.80（若1孔陽(yáng)性對(duì)照的OD值＜0.8應(yīng)放棄，若有2孔或2孔以上陽(yáng)性對(duì)照的OD值＜0.8，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。樣品OD值≥臨界值者為HIV抗體陽(yáng)性。 

ELISA試劑盒注意：關(guān)于篩查陽(yáng)性標(biāo)本，應(yīng)從頭取樣雙孔復(fù)試，復(fù)試陽(yáng)性者應(yīng)按照《全國(guó)HIV檢測(cè)管理規(guī)范》送HIV確證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。 質(zhì)量操控： 每塊板設(shè)陰陽(yáng)性及空白對(duì)照，并于每次實(shí)驗(yàn)用克己質(zhì)控血清作質(zhì)控，將質(zhì)控血清孔OD值采用“即刻法"核算或標(biāo)在質(zhì)控圖上，如質(zhì)控有效，標(biāo)明實(shí)驗(yàn)牢靠；如失控，則要查看試劑效期、貯藏溫度、試 驗(yàn)溫度是否正常、操作過(guò)程是否正確，直至從頭實(shí)驗(yàn)使其在控。