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技術(shù)文章

重組DNA分子電轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞

閱讀:391發(fā)布時(shí)間:2016-7-11

重組DNA分子電轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞

 

實(shí)驗(yàn)原理

宿主細(xì)胞是基因克隆載體的增殖場(chǎng)所,對(duì)于一個(gè)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞,具有以下幾個(gè)要求:

1、對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒(méi)有嚴(yán)格的限制。

2、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解載體DNA。

3、載體增殖過(guò)程中,不對(duì)載體DNA進(jìn)行修飾。

4、不會(huì)生產(chǎn)載體DNA的體內(nèi)重組。

5、容易導(dǎo)入重組DNA分子。

6、符合“重組DNA操作規(guī)則”的安全標(biāo)準(zhǔn)。

現(xiàn)在常規(guī)使用的是大腸肝菌XL1-Blue株K12株。本實(shí)驗(yàn)用XL1-Blue株。

試劑和器材

備用平板,冰盒,20uL槍,未開蓋的新槍頭盒。

重組DNA。

氨芐青酶素(AP)。

二甲苯甲酰胺(X-gal  20mg/mL,溶于二甲苯甲酰胺,無(wú)須濾過(guò)滅菌,分裝小包裝避光貯存于—20℃)。

IPTG。

XL1-Blue電擊細(xì)胞。

操作方法

1、鋪備用平板

    LB固體培養(yǎng)基200mL,融化后加200uL。→凝固后約半小時(shí),加入X-gal  80uL和IPTG  9uL。→涂布,37℃,約1h。→得備用平板。

2、電擊轉(zhuǎn)化

    電擊法依靠短暫的電擊,促使DNA進(jìn)入細(xì)菌。—70℃冰箱取電擊細(xì)胞XL1-Blue,冰上解凍。→取2uL重組DNA或鏈接產(chǎn)物于40uL電擊細(xì)胞中,混勻。→在電擊儀上將重組DNA分子轉(zhuǎn)入XL1-Blue細(xì)胞。→恢復(fù)生長(zhǎng)約半小時(shí)。→1200r/min,2~3min。→去掉大部分上清,剩200~300uL,用槍吹打混勻。→涂布備用平板。→37℃,培養(yǎng)過(guò)夜。→挑白色菌落。


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