酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備方法
酵母感受態(tài)細(xì)胞制備可以：（1）用于建立酵母轉(zhuǎn)化體系;（2）用于酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建;（3）用于酵母其他分子生物學(xué)研究。
一、試劑與耗材
1. 試劑
細(xì)菌用-酵母提取物（Fisher）、 細(xì)菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、細(xì)菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油（Sigma）、二甲基亞砜（Sigma）、聚乙二醇3350（Sigma）、醋酸鋰（Sigma）、鮭魚精子細(xì)胞DNA（Invitrogen）、酵母無氨基酸氮源（Sigma）、 2-（N-嗎啉代） 乙磺酸、腺嘌呤（Sigma）、葡萄糖。
2. 儀器
水浴鍋（VWR）、離心機（Eppendorf）、30 °C搖床與恒溫培養(yǎng)箱（VWR）、培養(yǎng)皿。
二、 試劑配方
1. YPDA液體或固體培養(yǎng)基
（1）1%酵母提取物： 10 g/L
（2）2%胰蛋白胨： 20 g/L
（3）2%葡萄糖：20 g/L
2. 轉(zhuǎn)化液
（1）聚乙二醇3350（50 % （w/v）：260 μl
（2）1 M醋酸鋰：36 μl
（3）SsDNA（10 mg/ml）：10 μl
（4）質(zhì)粒：3 μl
（5）總計：360 μl
3. YNB+ MA 培養(yǎng)基（100 ml）
（1）YNB：0.67 g
（2）2-（N-嗎啉代） 乙磺酸（20mM ）：0.39 g
（3）腺嘌呤：0.01 g
（4）瓊脂粉：2g
（5）葡萄糖：2g
三、制備步驟
1. 在轉(zhuǎn)化實驗的兩天前，于YPDA培養(yǎng)基的平皿上活化酵母菌株。
2. 轉(zhuǎn)化前一天，挑取活化的酵母細(xì)胞（單克?。┯赮PDA液體培養(yǎng)基中，30°C，200 rpm培養(yǎng)過夜。
3. 將培養(yǎng)過夜的酵母細(xì)胞液按1：3的比例轉(zhuǎn)接與新的YPDA液體培養(yǎng)基中，于30°C搖床內(nèi)，200 rpm培養(yǎng)4 h。
4. 3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細(xì)胞，用0.5倍體積的無菌水洗酵母細(xì)胞。
5. 再次3 000 g 離心 5分鐘。
6. 用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入適宜的離心管中，20°C ，3 000 g 離心 5分鐘。
7. 用0.01倍體積的無菌細(xì)胞懸浮液（5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亞砜）重懸酵母細(xì)胞。
8. 將重懸的酵母細(xì)胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。
9. 將管放入塑料盒或者紙盒中（逐步梯度冷凍能夠增強酵母的存活率）。
10. 將裝有酵母細(xì)胞的盒子放入-80°C冰箱。（細(xì)胞在-80°C能夠保存一年以上）。
