牛游離脂肪酸（NEFA)ELISA檢測試劑盒
檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被牛游離脂肪酸（NEFA)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的牛游離脂肪酸（NEFA)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
- 酶標儀（450nm）
- 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
- 37℃恒溫箱
牛游離脂肪酸（NEFA)ELISA檢測試劑盒操作注意事項
- 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
- 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
- 預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。
- 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
- 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無 |
標準品（1.5moml/L） | 0.5mL | 0.5mL | 按說明書進行稀釋 |
標準品稀釋液 | 6mL | 3mL | 按說明書進行稀釋 |
* | 6mL | 3mL | 按說明書進行稀釋 |
檢測抗體-HRP | 6mL | 3mL | 無 |
20×洗滌緩沖液 | 20mL | 20mL | 按說明書進行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無 |
底物B | 6mL | 3mL | 無 |
終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無 |
說明書 | 1份 | 1份 | 無 |
自封袋 | 1個 | 1個 | 無 |
注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：1.5、0.75、0.375、0.187、0093.、0moml/L.
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
- 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
- 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
牛游離脂肪酸（NEFA)ELISA檢測試劑盒操作步驟
- 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
- 設(shè)置標準品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
- 待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加*40μL；
- 隨后標準品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體50μL，，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
- 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
- 所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
- 所有孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
試劑盒性能
1. 準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于0.01 moml/L。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
6. 有效期：6個月
7. 檢測范圍：0.046moml/L-1.5moml/L
免責(zé)聲明
1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或牛體實驗，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責(zé)。
2. 嚴格按照說明書操作，不同批號不可交換使用，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。
