大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理 質(zhì)粒DNA或重組DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42°C短時(shí)間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。
實(shí)驗(yàn)材料 質(zhì)粒DNA重組DNA
試劑、試劑盒 LB培養(yǎng)基蒸餾水IPTGX-gal氨芐*
儀器、耗材 旋渦混合器微量移液取樣器移液器吸頭 離心管雙面微量離心管架干式恒溫氣浴恒溫水浴鍋制冰機(jī)恒溫?fù)u床培養(yǎng)皿超凈工作臺(tái)酒精燈玻璃涂棒恒溫培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C(jī)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺(tái)，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。
2. 試劑
培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。
3. 材料處理
無菌ddH2O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
二、操作步驟
1. 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。
2. 從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100 μl）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
3. 加入5 μl 連接好的質(zhì)?；旌弦海―NA含量不超過100 ng），輕輕震蕩后放置冰上20 min。
4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5 min。
5. 在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入500 μl LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。
6. 在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液100-300 μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
7. 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
8. 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱。
9. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。
10. 觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。
收起
注意事項(xiàng)
1. 玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂。
實(shí)驗(yàn)材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 CaCl2氨芐*LB
儀器、耗材 離心機(jī)分光光度計(jì)搖床
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 接種—個(gè)單菌落于50 ml LB培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)過（250 r/min）。
2. 往一個(gè)2 L 的燒瓶中加入400 ml LB培養(yǎng)液，再加入4 ml 過培養(yǎng)液，于37℃；搖床，培養(yǎng)至OD590為0.375。
3. 將培養(yǎng)液分裝到8個(gè)50 ml 預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 離心7 min。
4. 細(xì)胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2“溶液重懸，于4℃，以1 100 g 離心5 min 。
5. 細(xì)胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 離心5 min。
6. 用2 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸各管細(xì)胞，然后按每管250 μl 的量分裝于預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于- 70℃。
7. 按照以下各步驟用10 ng pBR322轉(zhuǎn)化100 μl 感受態(tài)細(xì)菌。
8. 將合適體積的轉(zhuǎn)化物涂于含有氨芐*的LB平板上，37℃培養(yǎng)過。
9. 將10 ng 加入到一個(gè)15 ml 無菌的圓底試管中，并放置冰上。
10. 將盛有感受態(tài)細(xì)胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。
11. 立即將100 μl 感受態(tài)細(xì)菌加 入到管中，輕輕旋動(dòng)，并放置冰上10 min 。
12. 將管故入42℃水浴2 min 進(jìn)行熱休克，然后加入1 ml LB 培養(yǎng)液于每一支試管中。
13. 于37℃置滾筒式搖床口培養(yǎng)1 h。
14. 將幾個(gè)稀釋度菌液涂布于含合適抗生素的平板上，于37℃培養(yǎng)12~16 h。
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