實(shí)驗(yàn)方法原理 在基因工程操作中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)基本技術(shù)。感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。農(nóng)桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生。將正在生長的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞迅速冷凍于-70℃可保存相當(dāng)一段時(shí)間而不會(huì)對其轉(zhuǎn)化效率有太大的影響。
實(shí)驗(yàn)材料 土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株
試劑、試劑盒 YEB液體培養(yǎng)基酵母提取物牛肉膏蛋白胨蔗糖*氯化鈣*儲(chǔ)液
儀器、耗材 超凈工作臺(tái)恒溫?fù)u床冷凍高速離心機(jī)高壓滅菌鍋冰箱超低溫冰柜分光光度計(jì)接種針試管離心管離心管冰浴微量進(jìn)樣器吸頭
實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑
1. 儀器
超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，冷凍高速離心機(jī)，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰柜，分光光度計(jì)，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進(jìn)樣器及吸頭。
以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。
2. 材料
土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株或其它農(nóng)桿菌菌株
3. 試劑
（1）YEB液體培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，高壓滅菌。
（2）*（Rif）儲(chǔ)液：50 mg/ml
（3）20 mM CaCl2，高壓滅菌。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養(yǎng)。
2. 取培養(yǎng)菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5。
3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。
4、加入1000 μl 20 mM CaCl2，使農(nóng)桿菌細(xì)胞充分懸浮，冰浴30 min。
5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 μl預(yù)冷的20 mM CaCl2，充分懸浮細(xì)胞，冰浴中保存，24 hr內(nèi)使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存?zhèn)溆谩?br>
電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)
實(shí)驗(yàn)材料 農(nóng)桿菌菌種
試劑、試劑盒 HEPESNaOH*甘油
儀器、耗材 離心管離心機(jī)制冰機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑配制
1 mM HEPES的配制：稱取0.119 g HEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500 ml，用NaOH調(diào)pH至7.0，滅菌后待用。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 挑取單克隆接種于2 ml YEP（含50 mg/l*）液體培養(yǎng)基，28℃，250 rpm，振蕩培養(yǎng)。（如用5 mlYEP，需培養(yǎng)36 h）
2. 將菌液按1:100轉(zhuǎn)移至200 ml YEP（含50 mg/l*）培養(yǎng)液中，28℃，250 rpm，振蕩培養(yǎng)至OD=0.3(約4~5 h)。
3. 轉(zhuǎn)入50 ml的無菌離心管，4℃，4 000 rpm離心10 min，棄上清。
4. 用20 ml冰浴的HEPES(1 mM，PH7.0)重懸。
5. 4℃，4 000 rpm離心10 min，棄上清。
6. 重復(fù)4、5步驟2~3次。
7. 用2 ml冰浴的10%甘油重懸。
8. 每管100 μl分裝于1.5 ml無菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
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