實(shí)驗(yàn)方法原理
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡(jiǎn)便而敏感的免疫組化染色方法，是眾多免疫組織化學(xué)方法的一種。SABC法：一抗+ *標(biāo)記二抗+ 滴加試劑SABC（鏈霉卵白素+ 辣根酶標(biāo)記*）+ 辣根酶底物顯色。目前常用的親和素從鏈霉菌(streptomyces)培養(yǎng)物中提取，因此稱為鏈霉親和素—*—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法)。
*(biotin)為含硫的雜環(huán)單羧酸，分子量小，通過其羧基與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，從而可標(biāo)記抗體和酶。親和素(avidin)又稱抗*蛋白，是一種糖蛋白，在雞蛋白中被發(fā)現(xiàn)，分子量為68 000。*與親和素有很高的親和力，1個(gè)親和素分子上有4個(gè)*結(jié)合位點(diǎn)。在ABC法中，不對(duì)特異性*抗體進(jìn)行標(biāo)記，而用*標(biāo)記第二抗體，染色前按一定比例將親和素與*標(biāo)記的過氧化物酶混合，制成ABC合物，并使親和素分子上至少空出1個(gè)*結(jié)合位點(diǎn)。染色時(shí)，標(biāo)本中的抗原先與*抗體結(jié)合，后者再與*標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，然后加入ABC復(fù)合物，結(jié)合到第二抗體的*上，zui終形成的復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)了大量的酶分子。因此，敏感性更高。
實(shí)驗(yàn)步驟
一、洗載玻片
1. 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中，目的是為了是載玻片上的硅膠等除去，同時(shí)使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整，便于組織吸附。
2. 置于清水中清洗，除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4（大約沖一個(gè)小時(shí)左右）。
3. 將載玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37℃溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。
二、包埋組織
1. 在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊。
2. 將塑料模具盒蓋上，zui后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。
三、切片
1. 將包埋好的組織從模具上取下來(lái)，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向一致。
2. 調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5 um，如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40 ℃溫水中。
四、撈組織
當(dāng)組織載玻片置于40 ℃溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí)，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對(duì)照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候方向一致，以便觀察，再將撈出來(lái)的載玻片置于架子上，放入37 ℃溫箱中烘干。
五、脫蠟
依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據(jù)的是相似相溶的原理。一般在每個(gè)試劑中放10 min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，一般為12-15 min。
六、抗原修復(fù)
脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2浸泡10 min，從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3 min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。
七、血清封閉
冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5 min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來(lái)，然后放入37 ℃溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍（900 ul PBS：100 ul血清封閉液）。
八、加一抗
將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存。
九、加二抗
將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37℃溫箱中半小時(shí)。
十、加SABC
將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC， 然后置于37℃溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990ul PBS：10ul SABC）。
十一、加顯色劑
將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻） A：DAB B：H2O2 C：磷酸緩沖液
十二、復(fù)染
將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
十三、脫水
將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，zui后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。
十四、封片
用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。
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