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技術(shù)文章

反相液相色譜

閱讀：309發(fā)布時(shí)間：2015-6-1

實(shí)驗(yàn)材料    蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒    膠母液磷酸氫氧化鈉三氯乙酸磺基水楊酸冰醋酸考馬斯亮藍(lán)
儀器、耗材    高壓電泳儀IEF槽離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、樣品提取

1.  1 ml 原核表達(dá)細(xì)胞液離心取沉淀。

2.  沉淀用100 μl IEF樣品緩沖液裂解，離心取上清。

二、制膠

1.  安裝超薄膠裝置

2.  依次加入下述試劑

（1）膠母液  2 ml

（2）尿素  8 M/脫氣

（3）NP-40  0.2 ml

（4）兩性電解質(zhì)  2 ml

（5）10%過硫酸胺  50 ul

（6）TEMED  5 ul

3.  倒膠

三、電泳

1.  預(yù)電泳膠凝固后，拆卸制膠裝置，將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上（要求：電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤(rùn)，在凝膠支持膜與電泳槽面板間無氣泡）。
 
2.  將分別被陰陽(yáng)極緩沖液浸潤(rùn)的電極條置于膠面上將與陰陽(yáng)電極接觸的部位 ，蓋上電泳槽罩子，連通電源，200 V 預(yù)電泳10 min。

3.  電泳，將薄棉紙剪成小塊，輕輕置于預(yù)備點(diǎn)樣的膠面上，取10~15 ul 樣品液，點(diǎn)于薄棉紙上，蓋上罩子，連通電源進(jìn)行電泳

4.  電泳參數(shù)：200 V，30 min；400 V，30 min；800 V，4 hr。

四、染色

1.  固定，將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中，10 min。

2.  顯色，50℃下，將膠與支持膜放置于染色液中，顯色，直至條帶出現(xiàn)。


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