實(shí)驗(yàn)材料 核苷酸
試劑、試劑盒 SSC焦磷酸鈉SDS
儀器、耗材 培養(yǎng)箱水浴鍋
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 制備雙份的轉(zhuǎn)印細(xì)菌菌落或噬斑的硝酸纖維素濾膜（處理和干烤過(guò)）。
2. 在室溫下用3× SDS / 0.1%SDS溶液500 ml 洗膜3~5次。
3. 然后在65℃洗膜至少1.5 h 以上直至過(guò)。
4. 在預(yù)雜交液中37℃預(yù)雜交1 h。
5. 在裝有20 ml 以上的SSC雜交液的可封口的雜交袋中可移入多達(dá)20張的濾膜。
6. 在毎 個(gè)雜交袋中每毫升雜交液加入0.125 ng 至1.0 ng 的每種32P標(biāo)記的寡核苷酸。
7. 在以下給定的溫度條件下寡核苷酸雜交14~48 h。
（1）14堿基——室溫
（2）17堿基——37℃
（3）20堿基——42℃
（4）23堿基——48℃
8. 從雜交袋中取出濾胰，用6×SSC / 0.05%焦磷酸鹽洗膜液在室溫冼膜3~5次，每次 5~15 min。
9. 再用預(yù)熱的洗膜液洗膜30 min。預(yù)熱溫度與寡核苷酸片段長(zhǎng)度有關(guān)。
（1）14堿基——37℃
（2）17堿基——48℃
（3）20堿基——55℃
（4）23堿基——60℃
10. 如果濾膜高于本底放射性活性，則需要將洗膜溫度升高2~3℃，并延長(zhǎng)洗膜15~ 30 min。
11. 重新作放射自顯影檢測(cè)。但不得超過(guò)以下對(duì)應(yīng)的溫度：
（1）14堿基——41℃
（2）17堿基——53℃
（3）20堿基——63℃
（4）23堿基——70℃
12. 用塑料薄膜包裹濾膜，放好，使用增感屏在-70℃對(duì)X光片曝光14~72 h，雙份濾膜均對(duì)X光片曝光，如果在同一位置出現(xiàn)曝光點(diǎn)，那么該位置對(duì)應(yīng)的細(xì)菌菌落或噬斑為陽(yáng)性。
實(shí)驗(yàn)材料 寡核苷酸
試劑、試劑盒 LBSDSEDTATMAC
儀器、耗材 水浴鍋離心機(jī)培養(yǎng)箱尼龍膜
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 按“在氯化鈉/檸檬酸鈉中雜交"介紹的方法處理已影印細(xì)菌菌落的濾膜。
2. 按下列方法制備帶擴(kuò)增噬斑的濾膜
（1）從文庫(kù)中以漸減密度〔15 000~8 000噬斑 / 150 mm 平板）的方式將噬菌體鋪在瓊脂糖平板上。
（2）37 ℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出可見(jiàn)的噬斑。
（3）將噬斑影印到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜后，濾膜移至預(yù)熱的LB瓊脂糖平板上，37℃培 養(yǎng)5~12 h（轉(zhuǎn)印后冷室保存主平板）。
（4）將影印到膜上的噬菌體DNA變性并使之結(jié)合到濾膜上。
3. 轉(zhuǎn)印細(xì)菌菌落的濾膜按“在氯化鈉/檸檬酸鈉中雜交"的步驟1洗膜，然后將濾膜浸入50℃ 2×SSC / 0.5%SDS / 50 mmol/l EDTA，pH8.0溶液中洗滌，盡可能冼去濾膜上影印的細(xì)菌殘?jiān)缓笥猛蟮娜芤涸傧?遍。
4. 按每張濾膜5~10 ml 預(yù)溫的TMAC雜交液量，在15 cm 玻璃水晶盤(pán)中可移入多達(dá)30 張的濾膜，用塑料保鮮膜將玻璃盤(pán)封好。
5. 在雜交溫度下預(yù)雜交1 ~2 h。雜交溫度和洗膜溫度均應(yīng)比解鏈溫度低5~10℃。
6. 預(yù)雜交后，將濾膜轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝滿新鮮、預(yù)熱的TMAC雜交液的雜交容器中。
7. 并按毎毫升雜交液加入1×106~2×106 cpm35P標(biāo)記的寡核苷酸探針，于適當(dāng)?shù)臏囟认聹赜?0~60 h。
8. 室溫下每張濾膜先用5~10 ml TMAC洗液洗滌，然后分別將濾膜轉(zhuǎn)移到200~ 250 ml 新鮮的TMAC洗液中，輕輕振蕩洗滌15 min。
9. 換上等體枳預(yù)熱的TMAC冼膜液，在適當(dāng)?shù)南茨囟认聹赜? h。
10. 再用等體積的2×SSC / 0.1%SDS洗膜液在室溫下洗膜，共3次，每次約10 min，以去除TMAC。
11. zui后按“ 在氯化鈉/檸檬酸鈉中雜交"進(jìn)行放射自顯影。
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