【摘要】目的 建立三棱超臨界CO2萃取物中蘆丁的鑒別和含量測定方法。方法在聚酰胺膜上點樣，以80%乙醇作為展開劑鑒別蘆丁，采用Symmetry C18色譜柱，以乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸（14∶1∶85）為流動相，柱溫25℃，在流速為1.0 ml?min-1，360 nm的檢測波長下，測定蘆丁含量。結(jié)果在三棱的超臨界萃取物中含有蘆丁成分，建立的液相色譜方法在蘆丁濃度為0.003 40～0.02432 mg?ml-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定，平均加樣回收率為98.56%，以峰面積作精密度實驗，RSD為1.38%。結(jié)論三棱的超臨界萃取物中含有蘆丁，建立的液相色譜方法線性關(guān)系良好，精密度和回收率高，適合于三棱中蘆丁含量的測定。
【關(guān)鍵詞】 反相液相色譜； 薄層色譜鑒別； 蘆?。?超臨界萃取
Determination of Rutin in SFE Extract of Sparganium stoloniferum by RP?HPLC
LI Ke?yi， LIU Hong?mei*
(Biochemical Engineering College of Beijing Union University,Beijing 100023,China)
Abstract:ObjectiveTo explore whether there is rutin in SFE extract of Sparganium stoloniferum by TLC and establish a method to determine its content by RP-HPLC. Methods The determination was carried out over a Symmetry C18 column at 25℃. Methods tetrahydrofuran: 0.2% citric acid (14∶1∶85) was used as phase at a velocity of 1 ml?min-1 and the detection wavelength was set at 360nm. ResultsRutin was found in SFE extract of Sparganium Stoloniferum. The calibration curve was linear in the range of 0.003 40～0.02432 mg?ml-1 for rutin. The sample was stable within 8 hours and the recovery rate of rutin was 98.56 %. And in precision test, RSD=1.38%. ConclusionThere is rutin in SFE extract of Sparganium stoloniferum. The established RP-HPLC method has perfect linear relationship, high precision and recovery rate and it is suitable to determine the content of rutin in SFE extract of Sparganium Stoloniferum.
Key words: RP-HPLC; TLC; Rutin; Supercritical extract
三棱Sparganium stoloniferum，始載于《本草拾遺》，為常用中藥，是荊三棱科植物黑三棱的干燥塊莖，主要含揮發(fā)油類和黃酮類［1～3］，具有抗凝血及抗血栓和鎮(zhèn)痛作用［4］，臨床用于治療中風(fēng)病、冠心病、宮外孕、闌尾周圍膿腫及慢性肝炎、慢性盆腔炎等。另外其和莪術(shù)一起使用具有抑制腫瘤的功能［5］，在抗癌中藥的配方中起著非常重要的作用。目前文獻關(guān)于三棱的提取研究并不多，尤其是對其化學(xué)成分等基礎(chǔ)研究更少，文獻［6］報道的黃酮類成分為山萘酚和5,7,3',5'-四羥基雙氫黃酮醇-3-O-β-D-葡萄糖苷，還沒有三棱中含有蘆丁成分的文獻報道。因此本實驗采用薄層色譜法對三棱超臨界二氧化碳萃取物中蘆丁進行了鑒定，并利用液相色譜法對蘆丁的含量進行測定。
1 儀器與材料
1.1 儀器與試劑
江蘇南通華安公司的Ha120-50-01型超臨界萃取裝置；島津LC-10AT vp液相色譜儀，島津Shimadzu CLASS-VP V6.12 SP4工作站；KQ - 250B 型*。
1.2 對照品與供試品
三棱（北京同仁堂集團）；蘆丁對照品（中國生物制品檢定所）；甲醇（分析純）；乙腈（色譜純）；四氫呋喃（色譜純）；枸櫞酸（色譜純）；二氧化碳（99.95%）；本實驗用水均為超純水。
2 方法與結(jié)果
2.1 三棱超臨界提取物中蘆丁的薄層鑒別
2.1.1 供試品溶液的制備
三棱生藥粉碎、過40目篩、60℃烘干6 h ，稱1 000 g過篩的三棱粉，加入180 ml夾帶劑，充分混合，然后置于萃取釜中。對萃取釜、解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ分別進行加熱,當(dāng)溫度分別達到設(shè)定溫度時,通過高壓泵對萃取釜和兩個解析釜進行加壓,當(dāng)壓力分別達到設(shè)定壓力后,進行靜態(tài)萃取，之后開始循環(huán)萃取,并保持恒溫和恒壓,CO2流量為40 L/h。萃取2h后,從解析釜I和Ⅱ的出料口放出黃色油狀液體,萃取物稱重，量體積，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻得供試品溶液。
2.1.2 蘆丁對照品溶液I的制備
精密稱取蘆丁對照品1.0 mg，置于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.02 mg?ml-1的供試品溶液。
2.1.3 薄層鑒別
用定量毛細管分別吸取上述對照品溶液I、供試品溶液各20 μl，于聚酰胺膜上分別點樣，以80%乙醇作為展開劑，展開，晾干，以1%的三氯化鋁乙醇溶液顯色，置紫外燈下檢視，供試品溶液在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，說明樣品中含有蘆丁成分。
2.2 三棱超臨界萃取物中蘆丁含量的測定
采用液相色譜法測定樣品中蘆丁的含量。
2.2.1 色譜條件色譜柱：Symmetry C18（250 m×4.6 nm，5 μm）；流動相：乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸（14∶1∶85），柱溫25℃；檢測波長：360 nm，流速為1.0 ml?min-1，20 μl進樣（定量環(huán)）。在此條件下，30 min左右出峰，樣品中蘆丁和其他物質(zhì)分離良好。
2.2.2 色譜系統(tǒng)適用性實驗按蘆丁峰計算，色譜系統(tǒng)的理論塔板數(shù)為57 059；蘆丁與其前后相鄰的色譜峰的分離度分別為2.3和1.5，蘆丁與相鄰的色譜峰可以*分離。蘆丁峰的拖尾因子為1.07，峰形對稱性良好。
2.2.3 對照品溶液II的制備精密稱取蘆丁對照品15.0 mg，置于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.3 mg?ml-1的對照品溶液Ⅱ。
2.2.4 線性關(guān)系精密吸取對照品溶液Ⅱ 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 ml置于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。按“2.2.1"色譜條件測定。以峰面積為橫坐標、進樣濃度為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：
Y=-5.738 0×10-5+6.270 8×10-8X,r=0.999 9
結(jié)果：蘆丁在0.003 04 ～0.024 32 mg?ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2.5 樣品穩(wěn)定性實驗樣品溶液室溫放置，每隔2 h進樣一次，測定蘆丁的含量，共測5次，RSD為1.87%，說明樣品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.2.6 精密度實驗取同一濃度的樣品溶液，連續(xù)進樣6次，測定蘆丁的含量，RSD為1.38%。
2.2.7 加樣回收率實驗精密吸取5 ml已知含量的供試品溶液6份，分別置于10 ml量瓶中，分別準確加入5 ml濃度為0.30 mg?ml-1的蘆丁對照品溶液，搖勻，過濾，取續(xù)濾液分別進樣，按選定的色譜條件操作，測定其濃度，并計算回收率。結(jié)果見表1。表1 加樣回收率實驗結(jié)果
（略）
2.2.8 樣品的測定按上述“2.1.2"方法制備供試品溶液，并根據(jù)“2.2.1"色譜條件進行測定，用標準線性方程計算出各供試品溶液中蘆丁的含量，進而計算出基于每克生藥材的蘆丁含量。
2.3 三棱的超臨界萃取樣品測定根據(jù)表2的實驗條件安排實驗，實驗方法見“2.1.1"，每個實驗條件均重復(fù)3次,取平均結(jié)果，萃取物中蘆丁的含量如表2所示。表2 實驗結(jié)果（略）
3 討論
薄層色譜表明在三棱超臨界萃取物中含有蘆丁成分。
利用紫外分光光度法在200～500 nm的波長范圍內(nèi)掃描對照品溶液，在360 nm處對照品有zui大吸收，確定360 nm為檢測波長。
在HPLC流動相的選擇中，分別選擇了甲醇和乙腈為流動相的有機相，并分別考察了乙醇-水-磷酸和乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸兩個系統(tǒng)在不同配比、不同流速條件下對樣品測定的影響，zui后確定流動相為乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸（14∶1∶85）。
采用Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-四氫呋喃-0.2%枸櫞酸（14∶1∶85）為流動相，在流速為1.0ml?min-1，360 nm的檢測波長下，對三棱超臨界萃取物中蘆丁含量測定進行系統(tǒng)研究。建立的方法在蘆丁濃度為0.003 40～0.024 32 mg?ml-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定，平均加樣回收率為98.56%，方法具有很高的精密度，適用于檢測三棱中蘆丁的含量。
【參考文獻】
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