一. 試劑配制
1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )
9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加雙蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml雙蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M檸檬酸緩沖液，pH6.0）
28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（A.Citrate acid（檸檬酸）：10.5 g 加雙蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（檸檬酸鈉）：29.41 g加雙蒸水至1000 ml）。
3. 細(xì)胞通透液
由終濃度分別為0.3%雙氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加熱的36 ml PBS，再接著加120 ul TritonX-100，并加熱一會兒，冷卻至臨用前加0.4 ml 30％H2O2。
4. 5％羊血清或封閉血清，用PBS稀釋。
5. 含0.03％H2O2的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。
6. 一抗、二抗均用PBS稀釋。
7. Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、80％、70％、50％）、雙蒸水、中性樹膠（封裱劑）。
8. 蘇木精染液
二. 操作步驟
1. 脫蠟、水化
（1）60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；
（2）100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；
（3）95% ethanol 2 minutes；
（4）80% ethanol 2 minutes；
（5）70% ethanol 2 minutes；
（6） distilled water：5 min；
（7）PBS洗3次×3 min。
2、細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶
（1）用封閉通透液浸潤切片30 min（RT避光）。配法是用預(yù)熱40 ml PBS加120 ul TritonX-100加熱幾分鐘后，臨用前加400 ul 30％H2O2。
（2） PBS溶液洗3次×3 min。
3、抗原修復(fù)暴露抗原決定族
（1） 切片放入0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約6 min×4次，每次間隔補足液體，防止干片。
4、封閉非特異性蛋白
（1） PBS溶液洗3次×3 min；
（2）將切片取出，周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中,室溫30（10～30）min；
5、一抗孵育
（1） 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1：250、500、1000）后，放入濕盒中室溫1小時，然后4度過夜，從冰箱中取出需37 ℃復(fù)溫45 min。
6、二抗孵育
（1）將一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；
（2） 用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37 ℃恒溫烤箱中30 min（回收）。
（3）用PBS洗5次×5 min；
7、SP反應(yīng)
（1） 加入SP后放入37度烤箱中30 min。
（2） 用PBS洗5次×5 min；
8、顯色
（1）加入DAB（快速滴入，觀察染色情況，倒掉染液），顯色時間控制在約5 min（3～10 min），由鏡下觀察顏色控制時間。
0.05％DAB（避光）（1：20儲備液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB儲備液的配制：50 mg DAB+5 ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。
9、復(fù)染、脫水、透明、封片
（1）用PBS 3次×3min后，用雙蒸水洗5 min；
（2）加一大滴蘇木素染液，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20 s后自來水沖洗，雙蒸水洗5 min，再用PBS返藍(lán)5 min。
（3）脫水
（4）透明
Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min
（5） 封片
中性樹膠。
