實(shí)驗(yàn)方法原理 采用粘末端連接必須對(duì)目的DNA分子和載體分子進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的粘末端進(jìn)行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應(yīng)溫度不同，這時(shí)可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）*行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應(yīng)要求，加入第二種酶進(jìn)行酶切；3）使用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切。具體要根據(jù)酶的反應(yīng)要求進(jìn)行，盡量避免星號(hào)活力。
實(shí)驗(yàn)材料 質(zhì)粒DNA
試劑、試劑盒 限制性核酸內(nèi)切酶蒸餾水
儀器、耗材 微量移液槍離心機(jī)電泳儀水浴鍋?zhàn)贤馔干溆^測儀離心管記號(hào)筆
實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 材料：質(zhì)粒DNA。
2. 試劑：限制性內(nèi)切酶、ddH2O。
3 . 儀器：微量移液槍，離心機(jī)，水浴鍋， 電泳儀，紫外透射觀測儀。
二、單酶切
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：
（1）質(zhì)粒DNA：X μL（約1 μg）。
（2）限制性內(nèi)切酶：1 μL（約10 U）。
（3）10×buffer：2 μL。
（4）ddH2O：補(bǔ)足20 μL。
2. 混勻，做好標(biāo)記。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反應(yīng)。
5. 電泳檢測酶切效果。
三、雙酶切
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：
（1）質(zhì)粒DNA：X μL（約1 μg）。
（2）限制性內(nèi)切酶1：1 μL（約10 U）。
（3）限制性內(nèi)切酶2：1 μL（約10 U）
（3）10×buffer：1或2 μL。
（4）ddH2O：補(bǔ)足20 μL。
2. 混勻，做好標(biāo)記。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反應(yīng)。
5. 電泳檢測酶切效果。
四、結(jié)果與分析
假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個(gè)酶切位點(diǎn)， 且酶切*，紫外燈下檢測電泳結(jié)果，則單酶切應(yīng)為一條帶， 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數(shù)目多于理論值，那么有可能是酶切不*。如果酶切結(jié)果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣（超螺旋、線性和開環(huán)三條帶），則說明質(zhì)粒*沒有被切開。
收起
注意事項(xiàng)
1. 酶切的選擇原則一般是盡量擴(kuò)大酶切體系，這樣抑制因素得以稀釋；基因組DNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大，一般為1μg/10U；所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10，否則甘油濃度會(huì)超過5%，會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活力；對(duì)難切的質(zhì)粒或基因組DNA應(yīng)延長反應(yīng)時(shí)間4―5hr， 甚至過。滅活限制性內(nèi)切酶活性可以采用加熱滅活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具體每一種酶可能有些方法不能*滅活，這一點(diǎn)需要注意。
2. 雙酶切體系緩沖液添加量要根據(jù)兩種限制性內(nèi)切酶*緩沖體系，可以登錄限制性內(nèi)切酶購買公司查看。
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