(一)試驗原理

    新生哺乳動物胃腸道的生長發(fā)育非常迅速，這與初乳的攝入有關，初乳中含大量多肽類生長因子如胰島素等。本實驗通過體外犢牛小腸上皮細胞培養(yǎng)法，用細胞增殖率和葡萄糖吸收率作為細胞生長發(fā)育及功能成熟的指標，探討胰島素或其他生長因子對細胞生長發(fā)育的影響，同時為新生胃腸道營養(yǎng)發(fā)育生理研究提供研究方法。

(二)材料

1．待檢藥物胰島素(o．01μg／ml、0．1μg／ml、1μg／ml、10μg／ml及50μg／m1)。

2．動物出生1日齡以內未吮乳的中國荷斯坦犢公牛。

3．試劑DMEM／F12培養(yǎng)液、DMSO、臺盼藍、15％NCS、葡萄糖。

4．器材37℃水浴箱、酶標儀。

(三)實驗方法

1．細胞分離和培養(yǎng)出生1日齡以內未吮乳的中國荷斯坦犢公牛宰殺后放血，無菌條件下取十二指腸約10cm，迅速放人37℃生理鹽水中。按照Evans方法制取小腸細胞，用染色法進行細胞計數，存活的細胞活力大于85％時可進行細胞培養(yǎng)。將細胞按1×105／ml接種于24孔培養(yǎng)板上，在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。48h后更換為含不同濃度胰島素(0．01μg／ml、O．1μg／ml、1μg／ml、lOμg／ml及50μg／ml)的DMEM／F 12培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液作為對照。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，測定細胞增殖率。

2．細胞增殖率的測定 各組細胞更換培養(yǎng)液培養(yǎng)。72h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μl無血清的DMEM／F12及200μl 0．05％MTT，在5％C02、37℃孵箱中培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液和MTT，每孔加入O．5ml DMSO，用酶標儀測定0D540。

3．葡萄糖吸收率的測定配制葡萄糖濃度為4mg／ml的生理鹽水溶液，用其稀釋胰島素，使之濃度分別為O．Olμg／ml、O．1μg／m1、1μg／ml、10μg／ml及50μg／ml。細胞分離后在含15％NCS的DMEM／F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，分別用各實驗組生理鹽水孵育細胞30min，然后按試劑盒要求測葡萄糖吸收量(葡萄糖吸收量=總葡萄糖含量一剩余量)。

(四)結果與分析

    濃度為O．01μg／ml的胰島素作用很小，與對照組無顯著性差異(P>0．05)，無促細胞增殖及促進細胞吸收葡萄糖的作用。隨著濃度的增加，胰島素的促增殖作用及促細胞吸收葡萄糖的作用逐漸增強。但當胰島素濃度達到50μg／ml的超生理濃度時，胰島素反而抑制細胞增殖，并抑制細胞吸收葡萄糖。