HRP分子中與酶活性無關(guān)的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成Schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián)，在標(biāo)記前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后，再加入硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。

（1） 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸鹽緩沖液1ml中，加入1%DNFB無水乙醇溶液0.1ml，室溫下輕微攪拌1h；

（2） 加入新鮮配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml，此時(shí)溶液由原棕色變?yōu)槟G色，置4℃放置30min，此時(shí)溶液由原棕色變?yōu)槟G色；

（3） 加入2.5%乙二醇1ml， 室溫下輕微攪拌1h，終止反應(yīng)；

（4） 加入待標(biāo)記的抗體5-10mg， 用1.0mol/L， pH9.5 CBS，調(diào)節(jié)pH值至9.0；

（5） 混勻，置4℃過夜改良過碘酸鈉標(biāo)記法制備酶標(biāo)抗體

（6） 加入硼氫化鈉溶液0.1ml，混勻，4℃放置3h；

（7） 對0.01mol/L，pH7.4 PBS，4℃透析過夜，換液3次；

（8） 3000r/min離心30min，去除沉淀物；

（9） 收集上清液即為酶標(biāo)記抗體。

【注意事項(xiàng)】

（1） 在氧化HRP時(shí)，以pH5.6醋酸鹽緩沖液溶解酶為宜。

（2） 一般認(rèn)為氧化HRP 5mg， NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml為宜，不能低于0.015mol/L 0.5ml。

（3） 氧化HRP時(shí)間以15-30min為宜。

（4） 加入DNFB的目的是為了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。

（5） 加入乙二醇的目的是終止反應(yīng)；為便于在加入抗體后調(diào)pH值，故乙二醇要用0.05mol/L CBS配制。