乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是細(xì)胞能量代謝(糖酵解)中的一個(gè)重要的酶，可以催化乳酸生成丙酮酸，同時(shí)產(chǎn)生ATP。正常情況下LDH不能透過細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，LDH會(huì)從胞漿中露出，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LDH減少，培養(yǎng)液中LDH增多。因此LDH是質(zhì)膜完整性的標(biāo)志，也是檢測細(xì)胞活性的指標(biāo)，培養(yǎng)液中LDH越高就說明細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。

    LDH在有輔酶I攜帶氫的情況下，催化乳酸與丙酮酸之間的可逆反應(yīng)。在pH 10的條件下，以乳酸為基質(zhì)，經(jīng)LDH作用后，測定生成的丙酮酸量，從而推知LDH的活性。

(一)材料

1．96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)的待測細(xì)胞和對照細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

2．0．1mol／L*緩沖液、甘油酸7．505g、NaCl 5．85g，溶于雙蒸水至1000ml。

3．緩沖基質(zhì)液(pH 10．O)：70％*10ml，0．1mol／L*緩沖液125ml，0．1mol／L NaOH 75ml，加氯仿數(shù)滴防腐，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4．輔酶I溶液：輔酶I 10mg溶于2ml雙蒸水中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5．2，4一二硝基苯肼溶液：20mg 2，4一二硝基苯肼溶于10ml 10mol／L HCl中后，用蒸餾水定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6．丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的丙酮酸11mg，用0．1mol／L H2SO4溶解后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆?。此?biāo)準(zhǔn)液相當(dāng)于lμmol／L丙酮酸。

(二)方法

1．繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按表8-1操作。

    將各試管置于37℃水浴15min后，各管加入0．4 mol／L NaOH 10ml，混勻后室溫放置5min，以1號管為空白，將試管分別于440nm測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以LDH量為橫坐標(biāo)，各管吸光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．培養(yǎng)液中LDH測定，操作見表8—2。

(三)結(jié)果分析

    混勻后室溫下放置5min，以對照管為空白，440nm比色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性。本法操作簡便快捷，自然釋放率低，可用于CTL及NK細(xì)胞活性測定及藥物、化學(xué)物質(zhì)或放射引起的細(xì)胞毒性，現(xiàn)已有LDH法測定CTL活性試劑盒。

(四)注意事項(xiàng)

1．各管吸光密度值若過高，應(yīng)對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

2．確保每管的反應(yīng)時(shí)間一致。