免疫熒光組織化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時(shí)發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

    用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學(xué)分直接法、間接法和補(bǔ)體法。

1、直接法

（1） 檢查抗原方法

    這是zui簡便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接用于細(xì)胞或組織抗原的檢查。此法特異性強(qiáng)，常用于腎穿刺，皮膚活檢和病原體檢查，其缺點(diǎn)是一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。

（2）檢查抗體方法

    將抗原標(biāo)記上熒光素，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體在原位檢測出來。

2、間接法

（1）檢查抗體（夾心法）方法

    此法是先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。

（2）檢查抗體方法

    用已知抗原細(xì)胞或組織切片，加上待檢血清，如果血清含有切片中某種抗原的抗體，抗體結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體(抗種屬特異性IgG熒光抗體)與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢驗(yàn)血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。

（3）檢查抗原法

    此法是直接法的重要改進(jìn)，先用特異性抗體與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。同直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于同一種屬產(chǎn)生的多種*抗體的標(biāo)記顯示，這是現(xiàn)在zui廣泛應(yīng)用的技術(shù)。

3、補(bǔ)體法

（1）直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物方法

    用抗補(bǔ)體C3熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng)，而形成抗原-抗體-補(bǔ)體—抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物上補(bǔ)體存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。

（2）間接檢查組織內(nèi)抗原方法

    常將新鮮補(bǔ)體與*抗體混合同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原-抗體-補(bǔ)體—熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點(diǎn)是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的*抗體的檢查。

4、雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記方法

    在同一組織標(biāo)本上需要同時(shí)檢查兩種抗原時(shí)要進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧话憔捎弥苯臃?，將兩種熒光抗體（如抗A和抗B）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標(biāo)記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。