細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一。其基本原理是單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上時(shí)細(xì)胞數(shù)量已達(dá)60個(gè)左右，此細(xì)胞群體成為克隆或集落，大小在0．3～1．0mm之間。通過(guò)計(jì)數(shù)克隆形成率，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力做定量分析，了解細(xì)胞的增殖率和對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)性。克隆形成率高者其獨(dú)立生存能力強(qiáng)，例如永生性細(xì)胞或癌細(xì)胞克隆形成率高，正常細(xì)胞則很低。常用的方法有平板克隆形成試驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。

一、材料

1．待測(cè)的培養(yǎng)細(xì)胞。

2．細(xì)胞培養(yǎng)液．0．25％，PBS溶液，Giemsa染色液。

3．培養(yǎng)皿．吸管，培養(yǎng)板。

4．CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡。

二、方法

1．制備細(xì)胞懸液低密度細(xì)胞懸液一般根據(jù)需要配成]0~100個(gè)／ml。取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生單層培養(yǎng)細(xì)胞，吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，用0．25％消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在含10％牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中備用。

2．接種和培養(yǎng)用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，使之混懸均勻后，將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(根據(jù)增殖能力)接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5％CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。

3．觀察當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心洗2次。加純甲醇或1：3醋酸／甲醇5ml，固定15min。然后棄掉固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10~30min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

三、結(jié)果分析

1.計(jì)算各皿克隆數(shù)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

2．計(jì)算克隆形成率計(jì)算公式為：

克隆形成率=克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100%

四、注意事項(xiàng)

1．克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，細(xì)胞懸液中細(xì)胞應(yīng)分散充分，單個(gè)細(xì)胞比率至少在90％以上。此外，接種密度不能過(guò)大。

2．培養(yǎng)期問(wèn)應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適當(dāng)更換培養(yǎng)液。

3．平板克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。

4．由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱．腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。