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上海一研生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第11年

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檢測ELISA夾心法定量蛋白方法

時(shí)間:2016/11/29閱讀:1964
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檢測ELISA夾心法定量蛋白方法 

   測定前提的優(yōu)化用棋盤測定法測定5ng/ml的rhGM-CSF/IL-3,表明hGM-CSFMcAb的濃度為10μg/ml,rhIL-3PcAb的稀釋度為1:100。但目前尚無一簡便有效的檢測方法對(duì)rhGM-CSF/IL-3進(jìn)行定量檢測。100μl可以產(chǎn)生足夠陡的劑量反應(yīng)曲線,且本底低,是反應(yīng)體積。為了進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的藥效以及藥代動(dòng)力,必需對(duì)其進(jìn)行定量測定。綜上所述,本試驗(yàn)建立的ELISA夾心法檢測速度快、重復(fù)性好、敏捷度高、特異性好,可對(duì)樣品濃度低至50pg/ml進(jìn)行定量測定,幾乎不受其它生物活性物質(zhì)及血清成分的干擾,是對(duì)rhGM-CSF/IL-3進(jìn)行有效檢測的好方法。

大腸桿菌表達(dá)的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子/白細(xì)胞介素-3(rhGM-CSF/IL-3)融合蛋白進(jìn)行了中試純化研究,進(jìn)一步的研究表明rhGM-CSF/IL-3體外能促造血祖細(xì)胞的生長發(fā)育,具有較好的開發(fā)應(yīng)用遠(yuǎn)景?;趓hGM-CSF/IL-3的免疫特性,本文建立了ELISA夾心法定量檢測rhGM-CSF/IL-3。ELISA夾心法測定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白,用250mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS pH8.0)按適當(dāng)比例稀釋的rhGM-CSF McAb100μl包被微孔板,20℃16h,將A液(0.1%Tween-20的PBS)洗板5次,加200μl1%BSA-PBS溶液206h,A液洗板,甩干,-20℃保留備用。當(dāng)rhGM-CSF/IL-3濃度在0.49~6.25ng/ml時(shí)呈線性關(guān)系,回歸系數(shù)為r=0.995,建立的方法與各種血液組份和細(xì)胞因子無交叉反應(yīng),敏捷度49pg/ml,批內(nèi)變異系數(shù)為5.96%,批間變異系數(shù)為7.08%。使用時(shí)解凍,每孔加樣本100μl,4℃16h;A液洗板5次,加B液(0.1%Tweem-20,0.1%BSA in50mmol/L PBS,pH7.3)適當(dāng)稀釋的rhIL-3PcAb100μl1h;A液洗板5次,加100μl HRP-羊抗兔IgG,37℃1h;A液洗板,加100μl OPD顯色液(1mg/ml鄰苯二胺,0.012%H 2 O 2 ,100mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液,pH5.0),30min后用2mol/L H 2 SO 4 100μl終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀檢測OD 490nm 值。

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