(一)原代培養(yǎng)法

.將新生大鼠用頸椎脫位法處死，去除足趾及尾巴。70％酒精消毒后固定于解剖板上。

2.去除后腿皮膚，用血管鉗分離并剪切大腿肌肉。用含抗生素(00IU／ml、00μg／ml)的PBS沖洗2次。

3.將肌肉組織放人裝有用D—Hanks液配制的0．25％的溶液瓶中。瓶中預先放人一個磁棒，37℃(或室溫)磁力攪拌器上消化多次，每次0min。

4.利用沉淀法收集上清液中懸浮的細胞，未消化部分可繼續(xù)用同樣方法消化。

5.向細胞懸液中加入終濃度為0%的馬血清，終止消化作用。2500~3000r／min離心3~5min，用少量的培養(yǎng)液重新懸浮細胞，鋼網(wǎng)過濾細胞懸液。

6.計數(shù)懸液細胞數(shù)。調(diào)制細胞濃度為 X 06／ml。

7.接種細胞時，按60mm培養(yǎng)皿接種2～3×06細胞數(shù)為宜。37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

(二)骨骼肌細胞純化

    骨骼肌細胞的貼壁速度比非肌源性細胞慢，為此，可以用差速貼壁法獲得較高純度的肌源性細胞。具體方法是：

.取原代培養(yǎng)早期的細胞(培養(yǎng)30~40h)，經(jīng)洗滌后，用0．25%的溶液消化。細胞開始脫壁時以馬血清終止消化。

2．收集脫壁的細胞，洗滌后用培養(yǎng)液制備成細胞懸液。

3．立即接種到另一培養(yǎng)板上，貼壁40min。此時，多數(shù)非肌源性細胞已經(jīng)貼壁，而骨骼肌細胞仍懸浮在培養(yǎng)液中，或沉降到培養(yǎng)板上但未貼壁。

4．吸出未貼壁細胞，計數(shù)后將細胞調(diào)至所需細胞濃度，進行接種。

5．接種后，骨骼肌細胞純度可達到90％以上。該方法亦可用于直接經(jīng)溶液消化的肌肉組織細胞。

(三)骨骼肌細胞的克隆化培養(yǎng)

．明膠處理培養(yǎng)皿，將明膠覆蓋于培養(yǎng)皿一層即可。

2．制備飼養(yǎng)細胞將飼養(yǎng)細胞(可為鼠傳代細胞，或其他細胞)經(jīng)60GyX線照射后，以0．5～l×05個／皿鋪于培養(yǎng)皿。

3．將原代或傳代培養(yǎng)的骨骼肌細胞計數(shù)并進行有限稀釋，每培養(yǎng)皿接種25～00個細胞。在適宜的條件下，細胞增殖一代的時間為～3h。一般在培養(yǎng)3～6d開始形成克隆。在無飼養(yǎng)層細胞時亦可形成克隆，但易受培養(yǎng)條件影響而降低克隆形成率。

4．單一克隆分離及傳代，先以蠟筆標記出顯微鏡下觀察到的克隆，吸去培養(yǎng)液，以克隆環(huán)套住克隆并以硅脂封閉。向環(huán)中加l滴0．25％溶液。數(shù)分鐘后吸出細胞懸液，接種到新的培養(yǎng)板上。從原代培養(yǎng)的細胞獲得的克隆通?？蓚鳌?代，但肌源性細胞株則易于進行連續(xù)傳代，可克隆多次。

三、結果觀察

    在接種后數(shù)小時，多數(shù)細胞即可貼附至培養(yǎng)瓶(皿)。培養(yǎng)瓶中主要應為單個核的肌細胞．梭形、折光性較強可與非肌源性細胞相鑒別。接種培養(yǎng)約50h后，可見明顯細胞融合，并能形成纖維網(wǎng)。數(shù)天后細胞融合停止。融合后ld可見肌纖維的自發(fā)性收縮，l～2d后骨骼肌細胞的特征性橫紋變得明顯。利用放射自顯影、細胞化學及生物化學等方法可分析與融合有關的細胞合成活動的變化。

四、冷凍保存

    骨骼肌細胞也可以用冷凍保存的方式保種。

．將肌細胞消化后配成約06個／ml的細胞懸液，用含20％馬血清，2％DMSO的細胞培養(yǎng)液配制，每個2ml的凍存管中加入lml細胞懸液，做好標記。

2．先將凍存管置于4℃數(shù)小時，放于一20℃數(shù)小時。放在經(jīng)4℃預冷的壁厚lcm以上的泡沫塑料盒內(nèi)，置于80℃低溫冰箱中，使凍存管達到緩慢制冷的效果。l～2d后．可將凍存管放人液氮中保存。

3．解凍時，將凍存管從液氮罐中取出，立即放人37℃水浴中迅速解凍。臺式離心機離心500 r／min。然后吸去上清液，以新鮮培養(yǎng)液稀釋細胞沉淀，接種培養(yǎng)于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。也可不離心，直接將細胞懸液接種至培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。細胞貼壁后可按常復方法換液。