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噬菌體展示文庫體外篩選的通用步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：1373 發(fā)布時(shí)間：2010-8-14
1．通過腹腔注射濃度為1．25％（w/v）的阿佛丁來麻醉小鼠。
2．打開胸腔并暴露心臟。
3．用10ml的DMEM或PBS來灌注小鼠。
4．連同一個(gè)或多個(gè)對照器官一起，取出要研究的器官和組織，并將其置于一個(gè)直徑為30m的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
5．用無菌刀片將每個(gè)器官或組織都切碎。
6．將切碎的器官或組織放到2．2m1的無菌塑料管中，并加入1．8m1 0．5mg/m1的膠原酶。混勻并在37℃搖瓶孵育30分鐘。在37℃培養(yǎng)時(shí)，持續(xù)搖動樣品。
7．以1500r/min的速率短暫離心細(xì)胞懸液5分鐘，并棄去上清。
8．將每份用膠原酶處理過的器官或組織放到70txm的尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)上，并把懸液過濾到50m1錐形瓶中。加入10ml含1％BSA的DMEM到細(xì)胞濾網(wǎng)頂部，讓細(xì)胞都過濾到50m1錐形瓶中，加兩次。這使得細(xì)胞懸液的總量為20ml。在臺式臨床離心機(jī)中，以1500r/min離心5分鐘沉淀細(xì)胞。丟棄上清，并用20m1含1％BSA的DMEM洗滌沉淀兩次。
9．第6～8步也可用DAKO’s MediMachine制備來自器官或組織的單細(xì)胞懸液。將每份器官或組織分別放入50/1m的Medicon中，并置于MediMachine中打散2分鐘。用1ml的LHer注射器抽出Medicon中的細(xì)胞懸液，并通過?0gm的Filcon把單細(xì)胞懸液過濾到14m1的錐形瓶中。將1m1含1％BSA的DMEM加到MediCOn的小室中，并重復(fù)打散和抽濾的步驟。將整個(gè)循環(huán)重復(fù)3次。在臺式臨床離心機(jī)中，細(xì)胞懸液以1500r/min離心5分鐘。棄去上清，并保留細(xì)胞沉淀。
10．用1ml含1％BSA的DMEM重懸來自第8步或第9步的細(xì)胞，并在光學(xué)倒置顯微鏡下用Neubauer-ruled血球計(jì)數(shù)板來計(jì)數(shù)。
11．將每份器官或組織的細(xì)胞懸液都取出一部分，使得每個(gè)1．7ml塑料管中細(xì)胞總量約為1×107個(gè)。
12．將細(xì)胞在冰上放置5分鐘。
13．把109～1010TU或pfu的噬菌體加到細(xì)胞中，并加入含1％BSA的DMEM使其總體積為0．5～1ml。根據(jù)需要可以采用體積更大的噬菌體。
14．將噬菌體和細(xì)胞一起在4℃孵育30分鐘至過夜。低溫會阻止對所有已結(jié)合的噬菌體的內(nèi)吞作用。 當(dāng)檢測單克隆時(shí)，我們采用較短的時(shí)間，而當(dāng)篩選不同的初級文庫時(shí)，則采用較長的時(shí)間。
15．細(xì)胞懸液以5000r/min的速率短暫離心2～3分鐘，并棄去上清。
16．用含1％BSA的DMEM重懸細(xì)胞，輕輕吹打。以5000r/min的速率短暫離心細(xì)胞2—3分鐘，并棄去上清。再重復(fù)此操作3次，共洗滌4次。zui終，第5次用含1％BSA的DMEM重懸細(xì)胞沉淀，將其轉(zhuǎn)入一個(gè)新的2．2m1無菌塑料管中。以5000r/min短暫離心細(xì)胞2～3分鐘，并棄去上清。