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名稱(chēng)：大鼠細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）ELISA試劑盒

本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定大鼠組織勻漿或其它相關(guān)生物液體中CYP2E1含量。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的CYP2E1抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加進(jìn)標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、*化的CYP2E1抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*的黃色。顏色的深淺和樣品中的CYP2E1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ 值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為20 ng/ml，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e配制成20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，樣品稀釋液直接作為空缺孔 0 ng/ml。如配制10 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）20 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加進(jìn)含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。

6、 檢測(cè)溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋?zhuān)ㄈ纾?0 檢測(cè)溶液A / 990 檢測(cè)稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100 /孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。

7、 檢測(cè)溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測(cè)稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。

11、覆膜：5張

12、使用說(shuō)明書(shū)：1份

自備物品

1、 酶標(biāo)儀（建議儀器使用條件前預(yù)熱）

2、 微量加液器及吸頭，EP管

3、 蒸餾水或往離子水，濾紙

標(biāo)本的采集及保存

1、 組織勻漿：將動(dòng)物的組織標(biāo)本先用PBS洗滌，往除多余血液，勻漿化后放在5~10 ml PBS中于-20℃放置過(guò)夜，第二天，經(jīng)過(guò)二次反復(fù)凍融破膜，將勻漿物5000x g離心5分鐘，取上清即可檢測(cè)。

2、 其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保 存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，4 保存應(yīng)小于1周，-20 不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80 不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月；

操縱步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)猜測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1、 加樣：分別設(shè)空缺孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？杖笨准訕悠废♂屢?100 ，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 ，留意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時(shí)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效

性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2、 棄往液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。

3、 棄往孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4、 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。

5、 棄往孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6、 每孔加底物溶液90 ，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。

7、 每孔加終止溶液50 ，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加進(jìn)順序應(yīng)盡量與底物 液的加進(jìn)順序相同。

8、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)丈量各孔的光密度（ 值）。

注：

1、 試劑預(yù)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操縱中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2、 加樣：加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔假如太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到丈量值的正確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操縱，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4、 洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放進(jìn)反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí)，一次不要小于10 ），以避免由于不正確稀 釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液。

6、 反應(yīng)時(shí)間的控制：加進(jìn)底物后請(qǐng)定時(shí)觀(guān)察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹舆M(jìn)終止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7、 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

洗板方法

1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注進(jìn)孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸往（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上展墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

2、 自動(dòng)洗板：假如有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

特異性

本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或自然的大鼠CYP2E1，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

計(jì)算

各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本 值扣除空缺孔 值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則 應(yīng)取其均勻值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）， 值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線(xiàn)軟件進(jìn)行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回回方程式，將樣品的 值代進(jìn)方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

檢測(cè)范圍：0.312 ng/ml - 20 ng/ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)請(qǐng)取用以下濃度值：20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml。

zui低檢測(cè)限：0.078 ng/ml