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細(xì)胞總蛋白的提取及操作方法
最近更新時(shí)間：2011-12-8
提 供 商：上海科興商貿(mào)有限公司資料大?。?/span>66.2KB
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1、細(xì)胞總蛋白的提取
（2）裂解緩沖液：
50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4
150-300mM NaCl
1％（w/w）NP-40 （0.5%Triton-X100）
5mM EDTA（現(xiàn)加1ml加10ul）
臨用前加入蛋白酶抑制劑：
Na3VO4
釩酸鈉 1mM （75mM—13.3ul/ml）
（用0.2mol/L儲存液配制）
PMSF苯甲酰氟 1mM （10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml）
或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul）
Aprotinin * 10ug/ml（10ul/ml）
（Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加） Western blotting
（2）給你介紹一個裂解液：
50mM Tris-HCl （PH8.0）緩沖液，含：
NaCl 150mM
疊氮鈉 0.02%
SDS 0.1%
NP-40 1%
PMSF 100ug/ml（使用前臨時(shí)加入）（10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml）
盡量用少的裂解液裂解細(xì)胞，取上清電泳，用6xSDS 上樣buffer。
（3）懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)107重懸于0.5mlPBS（0.01M）中，加入飽和濃度一抗（1/10）或
（10ug/ml）4℃15-30min后，短暫離心4000 轉(zhuǎn)×3分，用PBS 0.4-0.5ml重懸（室
溫）,加入飽和濃度二抗（1/100）或 （20ug/ml）,迅速置于37℃水浴中2-5分后
（迅速加入終止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4
,5mM EDTA,10mM NaF））,
（4）離心4000 轉(zhuǎn)×3分，棄上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml（裂解濃度
108/ml？）吸管輕輕混勻，冰點(diǎn)緩慢震搖孵育30分鐘后加入10ul濃度為10mg/ml
的PMSF儲存液，冰點(diǎn)孵育30分鐘。4度離心15000g 20min。上清液即為全部細(xì)
胞溶解成分。
2、碧云天公司
Western 及IP 細(xì)胞裂解液的主要成分為20mM Tris（pH 7.5），150mM NaCl，1%
Triton X-100，以及焦磷酸鈉, β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin
等多種抑制劑。可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。（-20
℃保存，一年有效。）
如果是貼壁細(xì)胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即細(xì)胞培養(yǎng)液量
的1/20）加入裂解液。
3、軍科院
裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100ug/ml
PMSF）：
1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸餾水至 50ml
混勻后， 4℃保存。使用時(shí)，加入PMSF 至終濃度為100ug/ml（0.87ml 裂解液
加入1.74mg/ml PMSF50μl）
4、我的樣品蛋白是這樣制備的：
（1）．將與腺病毒轉(zhuǎn)染液共培養(yǎng)２４小時(shí)的細(xì)胞消化下來
（2）．離心收集細(xì)胞
（3）．向離心管里加入４０微升１×PBS 緩沖液，隨后再加入４０微升2×Lamily
buffer （由tris堿和SDS 組成）裂解細(xì)胞
（４）．將細(xì)胞裂解液放入沸水中加熱五分鐘，放冷后離心．
（５）．測定蛋白濃度，加樣電泳
我所說的前沿有蛋白是指膠的底端，不是指加樣孔下面有蛋白．膠的濃度應(yīng)該沒
問題。
5、細(xì)胞總蛋白操作方法：
（1）、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖?br />一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
（2）、每瓶細(xì)胞加 3ml 4 度預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min
洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將
PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
（3）、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無
結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）
（4）、每瓶細(xì)胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂
解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。
（5）、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍
將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行。）
（6）、于 4度下12000rpm 離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）
（7）、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min 的離心管中放于－20 度保存。