酶試劑是磷鎢酸和磷鉬酸的混合物，它在堿性條件下極不穩(wěn)定，可被酚類化合物還原產(chǎn)生藍(lán)色（鉬藍(lán)和塢藍(lán)的混合物）。ELISA試劑盒

    酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后產(chǎn)生的*可與酚試劑反應(yīng)，所生成的藍(lán)色化合物可用分光光度法測(cè)定。

    （1）酚試劑：見實(shí)驗(yàn)1-15Folin試劑乙；（2）0.55mol/L碳酸鈉溶液；（3）10%三氯乙酸溶液溶液；（4）0.5%酪蛋白溶液；稱取酪蛋白2.5g，用0.5mol/L的氫氧化鈉溶液4ml潤(rùn)濕，加0.02mol/L ph7.5磷酸緩沖液少許，在水浴中加熱溶解。冷卻后，用上述緩沖液定容至500ml。此試劑臨用時(shí)配制；（5）0.02mol/L ph7.5磷酸緩沖液；稱取*（NaHPO4·12H2O）71.64g,用水定容至1000ml為A液。稱取*（NaHPO4·2H2O)31.21g,用水定容至1000ml為B液。取A液840ml，B液160ml，混合后即成0.2mol/L（ph7.5）磷酸緩沖液。臨用時(shí)稀釋10倍；（6）100ug/mL*溶液；稱取烘干的*100mg，用0.2mol/L鹽酸溶液溶解，定容至100ml，臨用時(shí)用水稀釋10倍，在分別配置成集中10-60ug/mL濃度的*溶液（7）酶液；稱取1g枯草芽孢桿菌蛋白酶的酶粉，用少量0.02mol/L ph7.5的磷酸緩沖液溶解，然后用同一緩沖液定容至100ml。震搖約15min，時(shí)期充分溶解，然后用干紗布過濾。吸取濾液5ml，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)（如20/30或40倍）供測(cè)定用。此酶液可在冰箱中保存一周。

操作

1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

    取不同濃度（10-60ug/mL)的*溶液各1ml，分別加入0.55mol/l碳酸鈉溶液5ml，酚試劑1ml。置30℃恒溫水浴中顯色15min，用空白管（只加水，碳酸鈉溶液和酚試劑）做對(duì)照測(cè)定A680,以A680為縱坐標(biāo)，*的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、酶活力測(cè)定

    吸取0.5%酪蛋白溶液2ml置于試管中，在30℃水浴中預(yù)熱5min后加入預(yù)熱（30℃ 5min）的酶液1ml，立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)10min后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3ml，放置15min后，用濾紙過濾。ELISA試劑盒

    同時(shí)另作一對(duì)照管，即取酶液1m*加入3ml10%的三氯乙酸溶液，再加入0.55mol/L的碳酸鈉溶液5ml，混勻后再個(gè)加入酚試劑1ml，立即混勻30℃顯色15min。以加水的一管做空白，側(cè)對(duì)照及樣品的A680.

計(jì)算

    規(guī)定在30℃、ph7.5的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生*1ug為一個(gè)活力單位，則1g枯草芽孢桿菌蛋白酶在30℃，PH7.5的條件下所具有的活力單位為；

(A樣-A對(duì)）·K ·N

    式中A樣；樣品液的A680; A對(duì)；對(duì)照液的A680; K；標(biāo)準(zhǔn)曲線上A680為1時(shí)的*微克數(shù)；t；酶促反應(yīng)的時(shí)間（min），本實(shí)驗(yàn)  V:酶促反應(yīng)管總體積（ml），本實(shí)驗(yàn)V=6； N:酶液的稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)N=2000.ELISA試劑盒