軟瓊脂細(xì)胞克隆試劑盒特別適用于動(dòng)物或人體轉(zhuǎn)化型體細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)一致。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

實(shí)驗(yàn)開始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的所有試劑溶液放進(jìn)37℃恒溫水浴里預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。

一、 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25cm2）操作

1． 將克隆液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）

2． 放進(jìn)50℃恒溫水浴

3． 移出15毫升預(yù)熱的高養(yǎng)液（Reagent B）到50毫升錐形離心管

4． 移出15毫升克隆液（Reagent A）到50毫升錐形離心管

5． 輕度渦旋震蕩或用手搖動(dòng)錐形離心管，充分混勻

6． 最快速度分別移入3毫升（每個(gè)3毫升）到10個(gè)25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶

7． 用手輕輕抖動(dòng)，鋪滿整個(gè)底面，避免氣泡產(chǎn)生

8． 置于室溫下至少2小時(shí)，使膠體凝固

9． 準(zhǔn)備1瓶25cm2或75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞，清洗，脫落，計(jì)數(shù)

10． 移出1毫升（總量為2500個(gè)細(xì)胞）到15毫升錐形離心管

11． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

12． 小心抽去上清液

13． 加入2.25毫升預(yù)熱的中養(yǎng)液（Reagent C），用槍頭上下輕柔抽吸混勻（注意：用戶可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等）

14． 加入750微升克隆液（Reagent A），用槍頭上下輕柔抽吸混勻

15． 最快速度全部移入到1個(gè)25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶里，置于已凝固的膠體上面

16． 用手輕輕抖動(dòng)，鋪滿整個(gè)底面，避免氣泡產(chǎn)生

17． 置于室溫下至少2小時(shí)，使膠體凝固

18． 放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育

19． 次日，輕輕加入3毫升低養(yǎng)液（Reagent D）在膠體上面（注意：用戶可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等）

20． 1周后，再次加入3毫升低養(yǎng)液（Reagent D）在膠體上面

21． 2周后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞：細(xì)胞集落形成能力和效率（Clonogenicity/Efficiency），包括細(xì)胞集落數(shù)目、細(xì)胞集落大小，以及貼壁非依賴型生長(zhǎng)等

22． （選擇步驟）小心抽去低養(yǎng)液（Reagent D）

23． （選擇步驟）用細(xì)胞刮脫棒小心刮落含有細(xì)胞集落的中養(yǎng)層

24． （選擇步驟）用1000微升槍頭（翦去頂端部分）吸出細(xì)胞集落

25． （選擇步驟）加入到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶

26． （選擇步驟）加入3毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

27． （選擇步驟）用5毫升移液管抽吸，充分打碎細(xì)胞集落

28． （選擇步驟）放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育

二、細(xì)胞培養(yǎng)板（12孔板）操作

1． 將克隆液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）

2． 放進(jìn)50℃恒溫水浴

3． 移出10毫升預(yù)熱的高養(yǎng)液（Reagent B）到50毫升錐形離心管

4． 移出10毫升克隆液（Reagent A）到50毫升錐形離心管

5． 輕度渦旋震蕩或用手搖動(dòng)錐形離心管，充分混勻

6． 最快速度分別移入1.5毫升（每孔1.5毫升）到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔里

7． 用手輕輕抖動(dòng)，鋪滿整個(gè)底面，避免氣泡產(chǎn)生

8． 置于室溫下至少2小時(shí)，使膠體凝固

9． 準(zhǔn)備1瓶25cm2或75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞，清洗，脫落，計(jì)數(shù)

10． 移出1毫升（總量為2500個(gè)細(xì)胞）到15毫升錐形離心管

11． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

12． 小心抽去上清液

13． 加入1.125毫升預(yù)熱的中養(yǎng)液（Reagent C），用槍頭上下輕柔抽吸混勻（注意：用戶可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等）

14． 加入375微升克隆液（Reagent A），用槍頭上下輕柔抽吸混勻

15． 最快速度全部移入到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)孔里，置于已凝固的膠體上面

16． 用手輕輕抖動(dòng)，鋪滿整個(gè)底面，避免氣泡產(chǎn)生

17． 置于室溫下至少2小時(shí)，使膠體凝固

18． 放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育

19． 次日，輕輕加入500微升低養(yǎng)液（Reagent D）在膠體上面（注意：用戶可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等）

20． 1周后，再次加入500微升低養(yǎng)液（Reagent D）在膠體上面

21． 2周后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞：細(xì)胞集落形成能力和效率（Clonogenicity/Efficiency），包括細(xì)胞集落數(shù)目、細(xì)胞集落大小，以及貼壁非依賴型生長(zhǎng)等

22． （選擇步驟）小心抽去低養(yǎng)液（Reagent D）

23． （選擇步驟）用細(xì)胞刮脫棒小心刮落含有細(xì)胞集落的中養(yǎng)層

24． （選擇步驟）用1000微升槍頭（翦去頂端部分）吸出細(xì)胞集落

25． （選擇步驟）加入到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)孔里

26． （選擇步驟）加入3毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

27． （選擇步驟）用5毫升移液管抽吸，充分打碎細(xì)胞集落

28． （選擇步驟）放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育