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枯草芽孢桿菌常用培養(yǎng)基的配制
2017-3-9 閱讀(1482)
枯草芽孢桿菌常用培養(yǎng)基的配制方法;
1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20g瓊脂
枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備
1 培養(yǎng)枯草芽孢桿菌
取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜面分別接一環(huán)到裝有液體*培養(yǎng)基（CM）的試管中，36℃振蕩培養(yǎng)14 h，各取1 mL 菌液轉(zhuǎn)接入裝有20 mL 液體*培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，36℃振蕩培養(yǎng) 3 h，使細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其終濃度為0.3 u/mL，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 h。
2. 收集細(xì)胞
各取菌液10 mL，4000 r/min 離心10 min，棄上清液，將菌體懸浮于磷酸緩沖液中，離心。如此洗滌兩次，將菌體懸浮10 mL SMM 中，每mL 約含108～109 活菌為宜。
3. 總菌數(shù)測定
各取菌液0.5 mL，用生理鹽水稀釋，取10-5、10-6、10-7 各1mL（每稀釋度作兩個平板）、傾注*培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24 h 后計數(shù)。此為未經(jīng)酶處理的總菌數(shù)。
4. 脫壁
二株親本菌株各取5 mL 菌懸液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶濃度為100 ug/mL，混勻后于36℃水浴保溫處理30 min，定時取樣，鏡檢觀察原生質(zhì)體形成情況，當(dāng)95%以上細(xì)胞變成球狀原生質(zhì)體時，用4000 r/min 離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，然后將原生質(zhì)體懸浮于5 mL 高滲緩沖液中。立即進(jìn)行剩余菌數(shù)的測定。
5. 剩余菌數(shù)測定
取0.5 mL 上述原生質(zhì)體懸液，用無菌水稀釋，使原生質(zhì)體裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL，涂布于*培養(yǎng)基平板上，36℃培養(yǎng)24～48 h，生長出的菌落應(yīng)是未被酶裂解的剩余細(xì)胞。
計算酶處理后剩余細(xì)胞數(shù)，并分別計算二親株的原生質(zhì)體形成率。原生質(zhì)體形成率＝未經(jīng)酶處理的總菌數(shù)一酶處理后剩余細(xì)胞數(shù)。
