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江蘇菲亞生物科技有限公司
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細(xì)胞冷凍保存的方法
2017-3-9 閱讀(885)
1、材料：
生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO（Sigma D-2650）、無菌塑料冷凍保存管（Nalgene 5000-0020）、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)（KRYO10SeriesII）。
2、冷凍保存方法：
（1）傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時(shí)（或隔夜）→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
3、步驟：
（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。
（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5～10％，混合均勻，置于室溫下待用。
（3）依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液（約0.1ml）計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。
4、注意事項(xiàng)：
（1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好（logphase）且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。
（2）冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
（3）注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色（以0.22micron FGLP flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
（4）冷凍保存之細(xì)胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。
③adherent tumor lines：5～7×106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
（5）冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。
