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江蘇菲亞生物科技有限公司
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細胞凋亡的幾種檢測方法
2018-10-26 閱讀(828)
一、形態(tài)學觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現(xiàn)象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區(qū)別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。
二、DNA凝膠電泳
?。ㄒ唬?、檢測原理
細胞發(fā)生凋亡或壞死，其細胞DNA均發(fā)生斷裂，細胞內小分子量DNA*斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現(xiàn)DNA*斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180－200bpDNA*斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區(qū)別。
?。ǘ┙Y果判斷
正常活細胞DNA電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。
三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA*斷組成，可由ELISA法檢測。
（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體’
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合‘
4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合’
4、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量。
四、流式細胞儀定量分析
（一）檢測原理
細胞發(fā)生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。
（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1）、檢測的細胞數(shù)量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態(tài)比較準確
2）、可以做許多相關性分析
3）、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期
