氯霉素類藥物的危害及檢測目的

氯霉素類藥物主要包括氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，又稱為酰胺醇類，屬于廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用。由于氯霉素合成容易價格低，治療食品動物傳染性疾病效果較好，所以有在養(yǎng)殖過程中使用氯霉素的違法行為，從而造成動物源性食品中氯霉素殘留。研究證明氯霉素可引發(fā)人體造血系統(tǒng)疾病，產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等危害。2020年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號，將氯霉素及其鹽、酯列入《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中。

   本文闡述了如何將氯霉素類藥物從樣品基質(zhì)中分離提取出來，并經(jīng)過凈化后，轉(zhuǎn)化成液質(zhì)聯(lián)用儀可以檢測的形式。以提取、凈化為重點(diǎn)，依據(jù)國標(biāo)GB/T 22338-2008，為檢測人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。

檢測項目：氯霉素類藥物

應(yīng)用范圍：動物源性食品/水產(chǎn)品//畜禽產(chǎn)品/畜禽副產(chǎn)品

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

方法原理：針對不同動物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留，分別采用乙腈、乙酸乙酯-乙醚或乙酸乙酯提取，提取液用固相萃取柱進(jìn)行凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定，氯霉素采用內(nèi)標(biāo)法定量，甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外標(biāo)法定量。

前處理儀器：

高速組織搗碎機(jī)；均質(zhì)器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；分析天平；移液槍（200 μL 和1 mL）；心形瓶（100 mL棕色）；分液漏斗（200 mL）；聚四氟乙烯離心管（50 mL）；離心機(jī)；渦旋混合器；固相萃取裝置。

檢測儀器：LC-MS/MS+ESI源

試樣制備

從原始樣品中取出部分有代表性樣品，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均勻搗碎或混勻，用四分法縮分出適量試樣，均分成兩份，裝入清潔容器內(nèi)，加封后作出標(biāo)記，一份作為試樣，一份作為留樣，于-20 ℃條件下保存。

前處理方法

1.提取

動物組織（肝、腎除外）與水產(chǎn)品

稱取試樣5 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入100 μL氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D₅ 0.1μg/mL）工作溶液和30 mL乙腈，勻漿，離心5 min。將上清液移入250 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈飽和的正己烷，振蕩5 min，靜置分層，轉(zhuǎn)移乙腈層至100 mL棕色心形瓶中。殘渣中再加入30 mL乙腈，振搖3 min，離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至同一分液漏斗，振蕩5 min，靜置分層，轉(zhuǎn)移乙腈層至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5 mL正丙醇，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用氮?dú)獯蹈桑? mL丙酮-正己烷（1+9）溶解殘渣。

動物肝、腎組織

稱取試樣5 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入30 mL乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L pH 5.0），均質(zhì)2 min，加入300 μL β-葡萄糖醛酸苷酶，于37 ℃溫育過夜。消解樣品中加入100 μL氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D₅ 0.1 μg/mL）工作溶液，20 mL乙酸乙酯-乙醚（75+25），振搖2 min，離心5 min。取上層有機(jī)層入心形瓶中，在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用氮?dú)獯蹈?，? mL丙酮-正己烷（1+9）溶解殘渣。

蜂蜜

稱取蜂蜜試樣5 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入100 μL氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D₅ 0.1μg/mL）工作溶液，5 mL水，混勻，再加入20 mL乙酸乙酯，振搖2 min，離心5 min，移取有機(jī)層到100 mL棕色心形瓶中，于離心管中再加入20 mL乙酸乙酯，振搖2 min，離心5 min，合并有機(jī)層于棕色心形瓶中，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，3 mL水溶解殘渣，混勻。

2.凈化

動物組織與水產(chǎn)品

用5 mL丙酮-正己烷（1+9）淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將殘渣溶解溶液轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱上，棄去流出液，用5 mL丙酮-正己烷（6+4）洗脫，收集洗脫液于心形瓶中， 40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)獯蹈?，? mL水定容，定容液過0.45 μm濾膜至進(jìn)樣瓶，待測定。

蜂蜜

分別用5 mL甲醇，5 mL水活化EN固相萃取柱，將提取液轉(zhuǎn)移上柱，用5 mL水淋洗，用玻璃棒壓干1 min，用3 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈?，?/span>1 mL水定容，定容液過0.45 μm濾膜至進(jìn)樣瓶，待測定。

國標(biāo)解讀及注意事項

1.氯霉素類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用乙腈配成500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液在4 ℃避光條件下保存可以使用6個月。

2.不同的基質(zhì)使用不同的提取和凈化方法，注意內(nèi)臟組織需要酶解，β-葡萄糖醛酸苷酶只能冷藏，不能冷凍保存，否則會失活。

3.用水定容后，采用渦旋加超聲方式復(fù)溶，可以提高復(fù)溶效果。

4.由于質(zhì)譜檢測過程中掃描方式為負(fù)離子掃描（ESI-），建議專門使用一臺液質(zhì)儀，只進(jìn)行負(fù)離子掃描的檢測，保證檢測靈敏度。

5.可以在前處理過程中加入甲砜霉素和氟甲砜霉素相對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，校正回收率。

參考文獻(xiàn):GB/T 22338-2008 動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定

動物組織（肝、腎除外）與水產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留量測定的前處理流程圖

動物肝、腎組織中氯霉素類藥物殘留量測定的前處理流程圖

蜂蜜中氯霉素類藥物殘留量測定的前處理流程圖

*氯霉素類藥物信息表

壇墨質(zhì)檢對應(yīng)相關(guān)標(biāo)物