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檢測細胞衰老方法
2023-4-23 閱讀(99)
細胞衰老是細胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。衰老的細胞表現(xiàn)為細胞體積變大，呈扁平狀；細胞核變大，核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)聚集、固縮、裂解；胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加，有空泡形成；線粒體的數(shù)目及形狀發(fā)生改變；膜流動性降低；溶酶體內(nèi)容物增多，導致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細胞所具有的上述特征成為各種細胞衰老檢測手段的依據(jù)。
細胞衰老檢測方法與步驟:
（1）細胞接種前在6孔培養(yǎng)板中預先放置滅菌的細胞片，每孔加入1×10E5個細胞，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，使細胞在細胞片上生長。
（2）在超凈工作臺中吸棄6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入×1 PBS，洗滌細胞1次，隨后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，室溫條件下固定3~5分鐘。
（3）吸棄2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，加入×1 PBS，洗滌細胞3次，每次3分鐘。
（4）吸棄×1 PBS，加X-Gal溶液以浸沒細胞片為宜，37℃孵育4~8小時或過夜，用保鮮膜包被6孔培養(yǎng)板以防染液蒸發(fā)。
（5）取出細胞爬片，去離子水沖洗2次，再次用固定液固定4分鐘，流水輕輕沖洗。
（6）將細胞爬片按此順序脫水、透明∶95%酒精I（2分鐘）→95%酒精Ⅱ（2分鐘）→100%酒精I（2分鐘）→100%酒精I（5分鐘）→二甲苯I（2分鐘）→二甲苯Ⅱ（2分鐘）。
（7）中性樹膠封片。
（8）在普通光學顯微鏡下觀察衰老細胞形態(tài)。
每張片子鏡下計數(shù)400個細胞，確定X-Gal染色陽性細胞（衰老細胞）在細胞群體中的所占的百分比即衰老細胞率（藍染細胞數(shù)/總計細胞數(shù)×100%）。
注意事項:
（1）X-Gal溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。
（2）細胞固定時間過長或固定之后清洗不干凈，均會影響后續(xù)的酶反應。
