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PCR反應三大要素詳述
2024-2-26 閱讀(73)
PCR反應條件三要素為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。
溫度與時間的設置 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
1、變性溫度與時間：
變性溫度低，解鏈不全是導致PCR 失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物全變性，就會導致PCR失敗。
2、退火(復性)溫度與時間：
退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間全結(jié)合。
3、延伸溫度與時間：
Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增 10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。
4. 循環(huán)次數(shù)：
當其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30 輪循環(huán)擴增后, 反應中Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時產(chǎn)物量仍不夠, 需要進一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應底物進行擴增, 這樣經(jīng)60 輪循環(huán)后, 擴增水平可達109-1010。擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關,擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 為擴增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率, n 為循環(huán)次數(shù)。在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應，減少非特異性產(chǎn)物。
