L-抗壞血酸（也稱為weishengsuC）是動植物細胞分裂，生長和防御中的重要代謝產(chǎn)物。大多數(shù)哺乳動物肝臟中的葡萄糖均產(chǎn)生抗壞血酸。對于人類而言，必須從食物中獲取抗壞血酸才能生存，缺乏足夠的weishengsuC會導致壞血病，并zui終導致死亡。作為抗氧化劑，抗壞血酸可以降低患上諸如癌癥和心血管疾病等慢性疾病的風險。在食品工業(yè)中，抗壞血酸及其鈉鹽，鉀鹽和鈣鹽通常用作抗氧化劑食品添加劑，以防止不良的顏色和味道。AAT Bioquest' s Amplite™熒光抗壞血酸測定試劑盒提供了靈敏的熒光測定法，用于定量測定生物樣品中的總抗壞血酸和脫氫抗壞血酸（DHA）與抗壞血酸的比例。它利用酶反應將抗壞血酸氧化成DHA，可通過Ascorbrite™Blue用熒光酶標儀檢測。該測定法可以檢測樣品中的1uM總抗壞血酸。

1. 用稀釋的抗壞血酸標準液（50 µL）準備測試樣品

2. 加入等體積的工作溶液（50 µL）

3. 在室溫下孵育30分鐘至1小時

4. 監(jiān)測Ex / Em = 340/430 nm的熒光強度

重要說明
為了獲得*效果，強烈建議使用黑色印版。使用前在室溫下解凍套件組件。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復凍融循環(huán)。

1. Ascorbrite™藍色儲備溶液（200X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到Ascorbrite™藍色（組分A）中，制成200X Ascorbrite™藍色儲備溶液。

2.抗壞血酸標準溶液（100 mM）：
將200 µL ddH ₂ O加入抗壞血酸標準瓶（組分D）中，制成100 mM抗壞血酸標準溶液。

配制標準溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計

將10 µL 100 mM抗壞血酸加到990 µL分析緩沖液中，得到1000 µM抗壞血酸溶液（AA7）。然后取1000 µM抗壞血酸標準溶液并進行1：3連續(xù)稀釋，以得到連續(xù)稀釋的抗壞血酸標準溶液（AA1-AA6）。注意：抗壞血酸水溶液不穩(wěn)定，會氧化成DHA。

準備工作溶液

總AA分析
將5 mL分析緩沖液（組分C）加入一瓶酶混合物（組分B）中。然后將25 µL Ascorbrite ^TM  藍色儲備溶液（200X）加入同一瓶中。拌勻

DHA分析法
在適當?shù)娜萜髦?，加? mL分析緩沖液（組分C）和25 µL Ascorbrite ^TM  Blue儲備液（200X）。拌勻 注意：  或者，可以通過將100μLddH ₂ O加入一個Enzyme Mix瓶（組分B）中制成50X酶原液，制成酶原液，然后按比例用于總AA分析（例如，用于1mL總AA分析）工作溶液中，將20μL50X酶儲備溶液和5μL200X Ascorbrite™藍色儲備溶液加入1 mL測定緩沖液中。注意：  工作解決方案不穩(wěn)定。立即使用，避免直接暴露在光線下。

程序

表1.黑色96孔微孔板中抗壞血酸標準品和測試樣品的布局。AA =抗壞血酸標準品（AA1-AA7，1至1000 µM）；BL =空白對照；TS =測試樣品。

表2.每個孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和2的布局準備抗壞血酸標準品（AA），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50 µL。
   

2. 在抗壞血酸標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中加入50 µL工作溶液，以使總抗壞血酸測定體積為100 µL /孔。對于384孔板，將25 µL工作溶液加到每個孔中，總體積為50 µL /孔。
   

3. 將反應在室溫下孵育30分鐘至1小時。
   

4. 用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 340/430 nm處監(jiān)測熒光的增加（截止：420 nm）。

數(shù)據(jù)分析

100010010010- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Ascorbic Acid (uM)RFUHover mouse to interact

從空白標準孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對照。從其他標準的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標準讀數(shù)，以獲得標準曲線和方程式。該方程式可用于計算抗壞血酸樣品。