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產(chǎn)品描述
Single Cell Squence Specific Amplification Kit是基于一步RT-PCR的預(yù)擴(kuò)增方法，適用于單細(xì)胞或者微量總RNA中轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增，便于進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異的分析。本試劑盒實(shí)現(xiàn)了RNA提取純化、逆轉(zhuǎn)錄和PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)在同一管內(nèi)完成，不需要額外的操作，簡單高效，還能減少實(shí)驗(yàn)誤差和污染風(fēng)險(xiǎn)。除了應(yīng)用于單細(xì)胞，本試劑盒亦可適用于2~1,000個(gè)細(xì)胞的一步擴(kuò)增，應(yīng)用時(shí)僅需按照細(xì)胞數(shù)目減少一步擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)；獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物適合于任何實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析法。染料法和探針法qPCR分別推薦ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal, #22204)和2 × Q3 probe qPCR Master Mix (Universal, #22205)。
產(chǎn)品優(yōu)勢
? 一步法RT-PCR預(yù)擴(kuò)增：細(xì)胞裂解、RNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一管內(nèi)完成，不需要額外的移管操作。
? 一次可擴(kuò)增500個(gè)靶基因：擴(kuò)增產(chǎn)物適合用任何實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析。
實(shí)驗(yàn)案例
分別使用ToloBio #22121與競品Supplier A、Supplier B，對(duì)不同濃度的小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行一步法RT-PCR預(yù)擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)一步qRCR（ToloBio #22204）擴(kuò)增，比較在相同引物和相同細(xì)胞個(gè)數(shù)條件下的擴(kuò)增情況，包括擴(kuò)增靈敏度、擴(kuò)增線性和擴(kuò)增平臺(tái)。結(jié)果顯示，ToloBio #22121在不同濃度細(xì)胞（1～1000個(gè)細(xì)胞/test）條件下擴(kuò)增性能穩(wěn)定、優(yōu)異。
實(shí)驗(yàn)流程
1.Primer Pool的制備
將不同待測基因的擴(kuò)增引物進(jìn)行混合，制備成Primer Pool，使各引物的終濃度為0.1 μM。以Bcl-2基因?yàn)槔?，其上、下游引物原濃度均?00 μM，則應(yīng)各取1 μL加入998 μL RNase-free ddH2O至終體積為1 mL。多個(gè)基因引物對(duì)的制備依此類推，最多可混合500對(duì)不同基因的擴(kuò)增引物。
2.預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系
在RNase-free離心管中冰上配制如下反應(yīng)體系：
組分 | 體積 |
2 ×Tolo scAmp Reaction Buffer | 2.5 μL |
Primer Pool (0.1 μM) | 0.5 μL |
RT/Taq Enzyme Mix | 0.2 μL |
Cell sample a | 0.5~1 μL |
RNase-free ddH2O | Up to 5 μL |
a.細(xì)胞可儲(chǔ)存于PBS緩沖液中。
以上體系（除細(xì)胞樣本外）充分混勻后冰上放置備用，可加入1~1000個(gè)細(xì)胞樣本。為了使細(xì)胞充分破碎，將加入細(xì)胞樣本的完整體系置于-80℃冰箱2 min，隨后3,000 rpm (1,000 × g)室溫或4℃離心2 min，然后立即放入PCR儀進(jìn)行如下反應(yīng)：
程序 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 60 min | 1 cycle |
預(yù)變性 | 95℃ | 3 min | 1 cycle |
循環(huán)反應(yīng) b
| 95℃ | 15 sec | 20 cycles
|
60℃ | 15 min | ||
Hold | 4℃ | - | - |
b.建議循環(huán)數(shù)隨起始細(xì)胞數(shù)量作相應(yīng)調(diào)整：1個(gè)細(xì)胞20個(gè)循環(huán)，10個(gè)細(xì)胞17個(gè)循環(huán)，100個(gè)細(xì)胞14個(gè)循環(huán)，1,000個(gè)細(xì)胞11個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后，每管加入20 μL RNase-free ddH2O (1:5稀釋)，用移液器吹打混勻，室溫短離集于管底。可立即進(jìn)行后續(xù)qPCR定量反應(yīng)或-20℃短期保存。
3.qPCR反應(yīng)體系
冰上配制如下反應(yīng)體系：
組分 | 體積 |
2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal,#22204) | 10 μL |
Primer F (10 μM) | 0.5 μL |
| Primer R (10 μM) | 0.5 μL |
Template DNA c | 1 μL |
ddH2O | Up to 20 μL |
c.為減少加樣誤差，建議將1:5稀釋的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物再稀釋10倍后使用。
以上體系充分混勻后，短暫離心集于管底，隨后立即放入qPCR儀進(jìn)行如下反應(yīng)：
Stage | 程序 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
Stage 1 | 預(yù)變性 | 95℃ | 5 min | 1 cycle |
Stage 2
| 循環(huán)反應(yīng)
| 95℃ | 10 sec |
40 cycles
|
60℃ | 30 sec | |||
Stage 3 | 熔解曲線 | 儀器默認(rèn)程序 | 1 cycle |
產(chǎn)品組成
組分 | 22121 (200 rxns) |
● 2 × Tolo scAmp Reaction Buffer d | 500 μL |
● RT/Taq Enzyme Mix e | 40 μL |
○ RNase-free ddH2O | 2 × 1 mL |
d.包含 dNTP；
e.包含RTase、RNase inhibitor和Taq DNA polymerase；
保存條件
-20℃保存，≤ 0℃運(yùn)輸；
