高效液相色譜(HPLC)是一種進(jìn)行物質(zhì)分離、鑒定和定量的分析方法。與其它通常采用梯度模式的各種生物聚合物HPLC(離子交換、疏水相互作用和反相色譜)不同，SEC(尺寸排阻色譜法)通常采用等度方法。
尺寸排阻色譜法
尺寸排阻色譜法(SEC)包括凝膠滲透色譜法(GPC)和凝膠過濾色譜法(在含水條件下實行的一種特殊SEC法)，是利用球形顆粒多孔基質(zhì)作為固定相的一種分析方法。小分子能夠滲透到篩孔中并被截留。與此相反，大分子則不能進(jìn)入篩孔，只能以線性流速通過色譜柱。因此，分子根據(jù)其大小進(jìn)行分離，大分子先從色譜柱中洗脫出來，而后才是小分子從色譜柱中洗脫出來。
SEC是一種常用于生物聚合物的分離方法。目前的應(yīng)用領(lǐng)域如下：
測定分子量，例如抗體免疫球蛋白G。
作為一個研究構(gòu)象變化的工具用于下游加工(后續(xù)加工和產(chǎn)品凈化)。
特殊應(yīng)用：用于肽和蛋白質(zhì)混合物的自動化樣品制備的SEC限制介入色譜柱。
幾十年來，生物制藥在醫(yī)藥市場上已經(jīng)占據(jù)了重要地位。在這些生物制藥產(chǎn)品中，有醫(yī)藥用酶、、各種激素——如胰島素、依泊汀或生長激素、單克隆抗體(mAbs)和生物工程疫苗。
SEC分析是下游加工中的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于通過重組生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)和抗體來確定生物制造期間靶分子的純度和聚集狀態(tài)。
確定分子量間的差異來檢測污染物和聚合物是基于高純洗脫液的使用，高純洗脫液不會與固相發(fā)生任何反應(yīng)。
SEC所需特殊質(zhì)量的水可以從各個制造商處購買，或者直接使用艾柯實驗室純化水系統(tǒng)在現(xiàn)場按需直接制備。
水的實驗評估
本文對重組單克隆抗體進(jìn)行了定性研究，作為SEC分析使用的一個例子。所使用的解決方案源于我們的內(nèi)部方案。
在上游加工(溶液制備)期間，發(fā)酵培養(yǎng)基(宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、培養(yǎng)基成分，如白蛋白、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白)以及微生物和內(nèi)毒素產(chǎn)生的雜質(zhì)和污染物必須在下游加工中減少。這一過程也是雜質(zhì)的來源(蛋白酶的加入，蛋白A的泄漏)。mAb產(chǎn)物本身也能形成雜質(zhì)，例如分裂的或聚集的抗體，mAb的脫酰胺或氧化形式或錯誤折疊分子，對此必須進(jìn)行檢測。
對于靶蛋白純度的質(zhì)量控制，根據(jù)其分子量分離，采用SEC等方法來檢測聚集的抗體。
