該試劑盒采用探針法四重實時熒光定量PCR技術(shù)，針對羊源、鴨源、豬源、牛源性成分核酸序列設(shè)計特異性引物和熒光探針，通過實時熒光定量PCR(Taqman探針法) 擴(kuò)增曲線判斷肉及肉制品中羊源、鴨源、豬源、牛源性成分核酸進(jìn)行定性及定量檢測。

適用儀器：

ABI系列 (ABI 7300/ABI 7500/Step One等)，羅氏LightCycler系列，伯樂CFX 96 ，北京鯤鵬基因X系列，三獅生物Q162D等實時熒光定量PCR儀。

實驗操作：

1. 樣本制備 (樣本制備區(qū))

參照總DNA/RNA提取試劑盒說明書，或使用ES08全自動核酸提取儀配套快速核酸提取試劑盒 (磁珠法)，或其他符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的核酸提取試劑盒/方法，對樣本進(jìn)行核酸提取。提取的核酸盡量及時進(jìn)行檢測，否則于-20℃保存。

2.配制反應(yīng)體系 (加樣區(qū))

2.1 取出多重反應(yīng)液管，陽性對照管，陰性對照管，室溫條件下使試劑解凍，離心10秒，將管壁和管蓋內(nèi)的液體離心至管底，放在冰盒中備用。

2.2 取實驗所需的PCR反應(yīng)管 (n+2 ，即n個待檢樣本+陽性對照+陰性對照) ，反應(yīng)液充分吹吸混勻后，分別吸取 24μL反應(yīng)液至每個PCR反應(yīng)管內(nèi)，然后依次添加 1μL陰性對照、樣本核酸和陽性對照，蓋好管蓋，作好記錄，每個反應(yīng)總體積為 25μL 。充分混勻，離心 30 秒后在 實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增實驗。

3.熒光PCR擴(kuò)增 (擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))

95℃預(yù)變性 5 分鐘；95℃變性 10 秒，58℃退火延伸 30 秒，40 個循環(huán)，在 58℃時收集熒 光信號。熒光基團(tuán)選擇FAM/VIC/ROX/CY5 ，淬滅基團(tuán)選擇None。

4.結(jié)果判定

4.1 陽性對照FAM/VIC/ROX/CY5 通道的Ct值均＜30 且出現(xiàn)“S"型擴(kuò)增曲線，陰性對照 無Ct值或Ct值≥40 且無“S"型擴(kuò)增曲線，實驗結(jié)果有效；否則應(yīng)重新進(jìn)行實驗。

4.2 待檢樣本FAM/VIC/ROX/CY5 通道的Ct值≤36 且出現(xiàn)“S"型擴(kuò)增曲線，判定為陽性。 FAM通道陽性表明樣本中含有羊源性成分，VIC通道陽性表明樣本中含有鴨源性成分，ROX通道陽性表明樣本中含有豬源性成分，CY5 通道陽性表明樣本中含有牛源性成分。

4.3 樣本檢測結(jié)果 36＜Ct＜40 ，判定為可疑。應(yīng)對樣本進(jìn)行復(fù)測，如復(fù)測Ct值＜40 ，且有 明顯的擴(kuò)增曲線，則判定為陽性，否則判定為陰性。

4.4 樣本檢測結(jié)果無Ct值或Ct值≥40 且無“S"型擴(kuò)增曲線，判定為陰性。