1.RNA相關(guān)操作須注意之問題
2.TRizol Reagent抽提法
TRizol Reagent是Gibco公司產(chǎn)品。
1.取新鮮的材料10g，去除土或培養(yǎng)基，洗凈，甩去明顯的水分，初步剪碎，置于一研缽中(研缽應(yīng)較大，陶瓷制品，確保能承受液氮)。
2.倒入適量的液氮，磨成粉末狀。
3.在研缽中加入30ml TRizol，用研棒將之涂布于所有粉末之上。
4.室溫靜置，讓其自然解凍，粉末逐漸變成黃土狀、褐土狀、泥漿狀，此時(shí)再加入20ml TRizol，并用研棒研磨，直至變成醬紅色的液體。(因取材的植物或植物部位的不同，顏色會(huì)有差異)
5.加4ml 氯仿，用手劇烈震蕩15秒，靜置2~3分鐘。應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)的現(xiàn)象是：上層水相無(wú)色，下層有機(jī)相呈深紅色。注意：劇烈振蕩相當(dāng)重要，否則將出現(xiàn)*相反的現(xiàn)象，即上層紅色、下層無(wú)色；或者其他異?，F(xiàn)象。
6.以12000g在2℃離心15min。
7.轉(zhuǎn)移水相(上層)到新離心管中。加2/3體積的異丙醇以沉淀RNA。
8.以12000g在2℃離心15min。
9.去上清。
10.加75%酒精浸泡洗滌，靜置10分鐘。
11.倒去酒精，干燥RNA。注意不要過(guò)于干燥，否則影響后續(xù)的RNA溶解。
12.將RNA溶于適量無(wú)RNase的 水中，并用槍頭來(lái)回吸幾次。
13.在室溫下，RNA濃溶液中也可能形成絮狀大團(tuán)沉淀。60℃水浴10分鐘左右，此間每隔幾分鐘用手指輕彈管底助溶，有可能*溶解，再回復(fù)至室溫時(shí)則不會(huì)再析出沉淀。也有可能始終無(wú)法*溶解，這大概是由于RNA溶液實(shí)在太濃。
14.用Parafilm膜將離心管蓋封死，將離心管裝于一專門的離心管盒(或其他適合的容器)中，保存于-70℃。避免反復(fù)凍融。
3.異硫氰酸胍小量抽提法
本方法基本參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第125-126頁(yè)，有簡(jiǎn)化，起始樣品可低達(dá)50mg。
1. 試劑
2. 操作步驟
1).稱取50mg的新鮮植物材料，堅(jiān)硬部分可用剪刀初步剪碎。
2).往一微型玻璃勻漿器中加入0.5ml變性液(指工作液，下同)，再加入植物材料進(jìn)行勻漿。注意：須保證植物細(xì)胞在變性液中被破碎。
3).至沒有明顯可見的細(xì)胞團(tuán)塊時(shí)，將勻漿轉(zhuǎn)入一5ml離心管。
4).往勻漿器中再加入0.5ml變性液，洗刷粘附的勾漿，轉(zhuǎn)入同一5ml離心管。
5).加入0.1ml的2M、pH4.0的醋酸鈉緩沖液，混勻。
6).加入1ml水飽和酚，混勻。
7).加入0.4ml的24∶1氯仿/異戊醇，混勻。
8).0-4℃靜置15分鐘。
9).4℃、10000g離心20分鐘，將上層水相移入一新的干凈5ml離心管中，加入1ml異丙醇，-20℃放置30分鐘以沉淀RNA。
10)4℃、10000g離心10分鐘。
11)
4.RNA的簡(jiǎn)易電泳檢測(cè)
由于RNA的易降解性，及RNA呈單鏈狀態(tài)存在的現(xiàn)實(shí)，RNA的電泳檢測(cè)需耍特殊的操作。以下是一種RNA電泳檢測(cè)的簡(jiǎn)易方法，但并不適用于為轉(zhuǎn)膜而進(jìn)行的RNA電泳或其他在電泳后仍有后續(xù)操作的RNA電泳。
1.稱取適量的電泳用瓊脂糖，倒入一RNA制膠三角瓶(或其他適當(dāng)容器)中，加入適量的電泳緩沖液。
2.加入溴化乙錠(EB)溶液至終濃度為0.5ug/ml。
3.加入DEPC至終濃度為0.01%。注意：EB和DEPC均為劇毒和致癌物質(zhì)。
4.將三角瓶按高溫高壓滅菌的要求進(jìn)行封口。
5.混勻。
6.前一天準(zhǔn)備RNA的電泳緩沖液，容器內(nèi)放置一小磁棒，加入DEPC至終濃度為0.01%，在磁力攪拌器上攪拌過(guò)夜。說(shuō)明：因電泳緩沖液中的Tris成份能與DEPC發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，通常認(rèn)為電泳緩沖液應(yīng)以DEPC處理過(guò)的水配制而不能以DEPC直接處理。實(shí)驗(yàn)室中采用本方法似乎并未造成不良后果。
7.將凝膠預(yù)混物和電泳緩沖液高溫高壓滅菌。(以下操作應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范)
8.取一只未使用過(guò)的、無(wú)菌的一次性塑料手套平鋪于公共的制膠平臺(tái)上，將RNA的電泳膠模(整套電泳裝置須確保無(wú)RNase)輕置其上，擺好梳子，保持水平。
9.將高溫高壓滅菌的凝膠置于微波爐中，以微火使之充分融化。按常規(guī)方式制膠。注意：慎防RNase污染。
10.用的、無(wú)RNase的加樣板/紙、加樣槍頭和上樣緩沖液加樣。
11.在預(yù)處理的電泳緩沖液中電泳。因電泳過(guò)程中EB會(huì)向陰極移動(dòng)，電壓可適當(dāng)偏高，電泳時(shí)間則適當(dāng)減短。
12.紫外燈下觀察、拍照。
