5.1實(shí)驗(yàn)原理 
5.1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的基本構(gòu)成 
PCR指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定模板（克隆或基因組DNA）的擴(kuò)增反應(yīng)，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用，包括用于DNA作圖、DNA測(cè)序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。 
PCR基本原理是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3’末端有引物存在的情況下，用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA得到程度的擴(kuò)增。在微量離心管中，加入與待擴(kuò)增的DNA片段兩端已知序列分別互補(bǔ)的兩個(gè)引物、適量的緩沖液、微量的DNA膜板、四種dNTP溶液、耐熱Taq dna聚合酶、Mg2+等。反應(yīng)時(shí)先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開(kāi)為單鏈狀態(tài)；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對(duì)，形成部分雙鏈，稱為退火；再將溫度升至合適溫度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，該片段又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此重復(fù)改變溫度，由高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸組成一個(gè)周期，反復(fù)循環(huán)，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。因此PCR循環(huán)過(guò)程為三部分構(gòu)成：模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下催化DNA鏈延伸合成。 
（1）模板DNA的變性 
模板DNA加熱到90~95℃時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙鏈解開(kāi)成為單鏈，稱為DNA的變性。變性溫度與DNA中G-C含量有關(guān)，G-C間由三個(gè)氫鍵連接，而A-T間只有兩個(gè)氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對(duì)要高些。故PCR中DNA變性需要的溫度和時(shí)間與模板DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、G-C含量高低等均有關(guān)。對(duì)于高G-C含量的模板DNA在實(shí)驗(yàn)中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO），并且在PCR循環(huán)中起始階段熱變性溫度可以采用97℃，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，即所謂的熱啟動(dòng)。 
（2）模板DNA與引物的退火 
將反應(yīng)混合物溫度降低至37~65℃時(shí)，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復(fù)合物。退火所需要的溫度和時(shí)間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并由于引物的長(zhǎng)度顯著短于模板的長(zhǎng)度，因此在退火時(shí)，引物與模板中的互補(bǔ)序列的配對(duì)速度比模板之間重新配對(duì)成雙鏈的速度要快得多，退火時(shí)間一般為1～2min。 
（3）引物的延伸 
DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的新鏈。延伸所需要的時(shí)間取決于模板DNA的長(zhǎng)度。在72℃條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40～60個(gè)堿基/秒。經(jīng)過(guò)一輪“變性-退火-延伸"循環(huán)，模板拷貝數(shù)增加了一倍。在以后的循環(huán)中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一輪循環(huán)以后，DNA拷貝數(shù)就增加一倍。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4min，一次PCR經(jīng)過(guò)30～40次循環(huán)，約2～3h。擴(kuò)增初期，擴(kuò)增的量呈直線上升，但是當(dāng)引物、模板、聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，便出現(xiàn)所謂的“平臺(tái)效應(yīng)"，即靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加。 
5.1.2 PCR反應(yīng)的五個(gè)元素 
參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為五種：引物、酶、dNTP、模板和Mg 2+ 。

5.1.2.1 引物 
引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。 
引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下原則： 
（1）引物長(zhǎng)度 
長(zhǎng)度要求在15～30bp，常用為20bp左右，引物過(guò)短時(shí)會(huì)造成Tm值過(guò)低，在酶反應(yīng)溫度時(shí)不能與模板很好的配對(duì)；引物過(guò)長(zhǎng)時(shí)又會(huì)造成Tm值過(guò)高，超過(guò)酶反應(yīng)的zui適溫度，且合成長(zhǎng)引物還會(huì)使費(fèi)用大大增加。 
（2）引物堿基構(gòu)成 
引物的G+C含量以40～60%為宜，因?yàn)镚+C含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)直接造成Tm值的過(guò)高或過(guò)低，都不利PCR反應(yīng)的進(jìn)行。ATGC隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 
（3）引物二級(jí)結(jié)構(gòu) 
應(yīng)盡量避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且兩條引物間不能形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則形成引物二聚體，PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生非特異的條帶。引物自身也應(yīng)無(wú)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)（限制性酶切位點(diǎn)除外），防止形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。