一個(gè)完整的基因芯片實(shí)驗(yàn)包括以下幾個(gè)步驟：研究課題的提出、芯片設(shè)計(jì)、樣品制備、雜交反應(yīng)、數(shù)據(jù)分析和處理。本文主要介紹其中的樣品制備(細(xì)胞標(biāo)本采集和組織標(biāo)本采集)的建議做法。

細(xì)胞標(biāo)本采集操作建議規(guī)程

1. 所有樣品均應(yīng)有樣品標(biāo)簽(注明樣品編號(hào))，同時(shí)有一張樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等。

2. 一張芯片實(shí)驗(yàn)一般要求細(xì)胞數(shù)在1E+08，建議設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和收獲細(xì)胞時(shí)可考慮多收集一些。

3. 貼壁與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，保留的細(xì)胞用PBS緩沖液洗一下，除去緩沖液，加溶液D*充分溶解細(xì)胞，放入液氮運(yùn)輸。樣品量以實(shí)際得到的total RNA為準(zhǔn)。

4. 血液：將白細(xì)胞分離出來(lái)，加溶液D充分溶解細(xì)胞，放入液氮運(yùn)輸。樣品量以實(shí)際得到的total RNA為準(zhǔn)。

5. 如果是細(xì)胞未經(jīng)溶液D處理，直接凍入液氮罐(不)。工作人員會(huì)對(duì)細(xì)胞作相關(guān)處理，以便為細(xì)胞記數(shù)。

6. 以上提到的均是新鮮細(xì)胞，對(duì)一些已老化或質(zhì)量不明的細(xì)胞，工作人員有權(quán)提出疑義，并要求退回或重新取樣。

不同組織抽提3-10μg mRNA所需組織量

器官/組織*     提取3μgmRNA所需組織量(克)     提取10μgmRNA所需織量(克)     總RNA得率[單位:毫克RNA/克組織]     mRNA所占百分比[%]
成人正常組織     肝     0.2083     0.6944     1.80 - 1.80 mg/g     0.80
成人正常組織     腦     缺數(shù)據(jù)     缺數(shù)據(jù)     1.30 - 1.30 mg/g     缺數(shù)據(jù)
成人正常組織     肺     0.3000     1.0000     1.00 - 1.00 mg/g     1.00
成人正常組織     心     0.5000     1.6667     0.60 - 0.60 mg/g     1.00
成人正常組織     胃     0.1852     0.6173     2.70 - 2.70 mg/g     0.60
成人正常組織     喉     0.3125     1.0417     1.20 - 1.20 mg/g     0.80
病理組織     結(jié)腸癌     0.2521     0.8403     1.70 - 1.70 mg/g     0.70
病理組織     胃癌     0.4317     1.4388     0.50 - 0.50 mg/g     1.39
病理組織     空腸腺癌     0.3571     1.1905     1.40 - 1.40 mg/g     0.60
病理組織     直腸癌     0.1604     0.5348     1.70 - 1.70 mg/g     1.10
病理組織     肝癌     0.1116     0.3720     3.84 - 3.84 mg/g     0.70
病理組織     肺癌     0.1282     0.4274     2.00 - 2.00 mg/g     1.17
考慮到個(gè)體差異以及樣品在研磨、勻漿等過(guò)程中的損失，客戶提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加1-2倍。

組織標(biāo)本采集操作建議規(guī)程

鋁箔     經(jīng)DEPC水浸泡過(guò)夜，78°C烘干，高壓滅菌后烘干
1.5 ml 微離心管
15 ml 聚丙烯離心管     市場(chǎng)有售RNAase-Free的相應(yīng)規(guī)格離心管
標(biāo)簽紙    
記號(hào)筆    
樣品登記表     由客戶專人填寫
液氮罐     應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來(lái)源
取材部位的病理切片     由客戶提供1-2張
注：

· 以下步驟1 - 5應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò)15分鐘，超過(guò)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的RNA降解。

· 對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行研究的取材部位。

1. 離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜;肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈(正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈)。

2. 在RNase-Free 0.9%生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。

3. 用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。

4. 填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等 。

5. 將液氮冷卻的組織放入樣品袋(每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織)，袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙(標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號(hào)、日期)，迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐。

6. 保留1-2張取材部位的病理切片。

基因芯片樣品的制備要點(diǎn)：

1.目的DNA的選擇對(duì)于大規(guī)模地研究基因表達(dá)問(wèn)題，需要分析每一個(gè)基因的表達(dá)。因此，選擇的目的DNA必須能夠代表要研究的各個(gè)基因。對(duì)于整個(gè)基因組序列全部已知的生物，zui直接的方法是用PCR擴(kuò)增基因組中每個(gè)已知的或預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框架(openreadingframe)，亦可以選擇自己感興趣的部分序列。對(duì)于沒(méi)有測(cè)序，或只有部分測(cè)序的基因組，或者對(duì)于那些有大量?jī)?nèi)含子的基因組，上述方法就不現(xiàn)實(shí)。在這種情況下，我們首先考慮采用表達(dá)序列標(biāo)記(EsT)?？梢詫蝹€(gè)EST的cD一NA克隆用作陣列DNA來(lái)源。對(duì)于還沒(méi)有基因組測(cè)序計(jì)劃或序列還未知的生物，可以利用cDNA文庫(kù)作為DNA來(lái)源。當(dāng)然這種文庫(kù)是經(jīng)歸整化處理過(guò)，以減少不必要的冗余。

用作陣列的DNA可以是雙鏈的，亦可以是單鏈的。但是其長(zhǎng)度是小于開(kāi)放閱讀框架，或小于1000bp的cDNA。這對(duì)于很多具有同源性的基因尤為重要。當(dāng)基因之間具有很高同源性時(shí)，選擇基因之間有差異的部分，這樣便可以提高基因之間的分辨度。所以，在考慮每個(gè)基因代表性的同時(shí)，應(yīng)充分考慮所研究問(wèn)題的具體情況。

2.pcR擴(kuò)增一般而言，100uLIPCR反應(yīng)體系得到的產(chǎn)物足以點(diǎn)?。?00個(gè)基因芯片。PcR通常是在96孔PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)際擴(kuò)增的反應(yīng)條件要根據(jù)所用的模板及引物來(lái)確定。但要盡量減少PCR反應(yīng)體系中的組分，盡量只用模板、引物、核昔酸、Mg標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和酶。不要用甘油或明膠，它們往往會(huì)粘附在陣列塊上而影響以后的點(diǎn)樣工作。

3.點(diǎn)樣前DNA準(zhǔn)備點(diǎn)樣以前，要將pcR產(chǎn)物清洗純化干凈，并且對(duì)DNA進(jìn)行一些處理，一般用異丙醇沉淀PCR產(chǎn)物，以除去酶、離子及核昔酸等。沉淀后用70%乙醇院1次，再用95%乙醇洗1次，待*干燥后，將所沉淀DNA重溶在3xSSC中，其濃度掌握在100ny…左右、由于處理的樣本量很大，一般直接在96孔板上直接操作，可選用能夠配置96孔板的離心機(jī)(如SavantSpeedVacPlussC210A)。當(dāng)把DNA溶于10～15tL13XSSC(pH7.0)中后，置于4”C至少12h。然后，將DNA溶液封存在一20C～4”C。

除極個(gè)別特殊的樣品外，大多數(shù)的生物樣品不能與基因芯片反應(yīng)。對(duì)此，應(yīng)該對(duì)樣品進(jìn)行提取擴(kuò)增獲取其中的目的蛋白質(zhì)或基因，然后標(biāo)記，可提高檢測(cè)的靈敏度和實(shí)驗(yàn)操作人員的安全性。