2.1.1 概念及原理：
濁點萃取法(cloud point extraction，CPE)〔1〕是近年來出現(xiàn)的一種新興的液—液萃取技術(shù)，它不使用揮發(fā)性有機溶劑，不影響環(huán)境。它以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點現(xiàn)象為基礎(chǔ)，改變實驗參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離。目前該法已成功地應(yīng)用于金屬螯合物、生物大分子的分離與純化及環(huán)境樣品的前處理中[2-5]。
CPE 法除了利用增溶作用外，還利用了表面活性劑另一個重要性質(zhì)——濁點現(xiàn)象。溶液靜置一段時間(或離心)后會形成兩個透明的液相：一為表面活性劑相(約占總體積的5%)；另一為水相(膠束濃度等于CMC)。外界條件(如溫度)向相反方向變化，兩相便消失，再次成為均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物質(zhì)如膜蛋白，與表面活性劑的疏水基團結(jié)合，被萃取進表面活性劑相，親水性物質(zhì)留在水相，這種利用濁點現(xiàn)象使樣品中疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離的萃取方法就是濁點萃取。圖1顯示了由溫度變化引發(fā)的這種相分離現(xiàn)象。溫度的改變，引起水化層的破壞，增強了表面活性劑的疏水性。
2.1.2 蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用：
CPE 法可用于分離膜蛋白、酶、動物、植物和細菌的受體，還可以替代一些分離方法如硫酸銨分級法作為純化蛋白的*步，與色譜方法聯(lián)用。另外，CPE 法分離純化蛋白質(zhì)已經(jīng)可以實現(xiàn)大規(guī)模操作。Minuth等人成功地進行了氧化酶濁點萃取的中試研究。雖然使用離心分離器可以使CPE大規(guī)模連續(xù)進行，但商品離心分離器用于CPE 的效率和容量仍需進一步研究。而且，他們發(fā)現(xiàn)相分離操作受細胞培養(yǎng)時產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)影響較大，體系兩相間密度差較小，表面張力較小，含產(chǎn)物的表面活性劑相的流變學(xué)行為較復(fù)雜，操作較難。表1列出了CPE法近幾年來在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用。
(1)CPE法用于分離純化膜蛋白
膜蛋白(內(nèi)嵌膜蛋白、外圍膜蛋白)硫水性強、難溶于水，抽提內(nèi)嵌膜蛋白時，既要削弱它與膜脂的硫水性結(jié)合，又耍使它保持硫水基在外的天然狀態(tài)，較難分離純化。由于表面活性刑具有兩親性，它一直作為腹蛋白理想的增溶劑。增溶時，膜蛋白琉水部分嵌入膠束的硫水核中而與膜脫離，又保持了膜蛋白表面的廢水結(jié)構(gòu)。相分離后，膜蛋白與表面活性劑共同析出，與親水性蛋白質(zhì)分離。所以，CPE 法在分離純化膜蛋白方面極有優(yōu)勢。
(2)與其它分析技術(shù)的聯(lián)用
CPE 可以作為液相色譜(HPLC)、流動注射分析(FIA)、毛細管電泳(CE)等儀器分析的樣品前處理方法，提高檢出靈敏度。表面活性別可以防止樣品吸附在玻璃容器上，易于與FIA中的載液及HPLC中的有機流動相或膠束流動相混合，可以直接進樣。但是在很多應(yīng)用中需要除去表面活性劑后再與儀器聯(lián)用。將萃取物與表面活性劑分離的方法很多。對于CMC＞1mM 的表面活性劑如兩性離子表面活性劑可用透析法，但操作時間較長(24h左右)。對于CMC 較小的表面活性劑可通過色譜柱分離除去，如凝膠柱、毛紉管柱等，分離出的表面活性劑可以再利用，也可以作焚燒處理。但CPE作為HPLC 的樣品前處理方法有兩個缺點：*，常用的表面活性劑在UV區(qū)域有很強的背景吸收。第二，操作時間較長，從色譜柱上需用幾個小時洗脫表面活性劑。表面活性劑的洗脫可能會干擾分析物的測定[3]。
2.2 置換色譜法：
2.2.1 概念及分離機理：
置換色譜(displacement chromatography)〔6〕作為一種非線性色譜技術(shù)，是指樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力*的置換劑(displacer)通人色譜柱，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。樣品在置換劑的推動下沿色譜柱前進，使樣品中各組分按作用力強弱的次序，形成一系列前后相鄰的譜帶，并在置換劑的推動下流出色譜柱[7]。置換色譜的分離行為與樣品組分和置換劑在實驗條件下的吸附等濕線有直接的。置換色譜要求樣品組分及置換劑的吸附等濕線應(yīng)為Langmuir 型，而且置換劑相對于被分離的各組分應(yīng)有zui強的吸附能力，其吸附等溫線位于所有組分的吸附等溫線的上方[7]，見圖1(A)。根據(jù)物料平衡方程，置換劑在柱中的移動速度uD有下列關(guān)系：
式中uD 為流動相的線速，ф為相比，qD 和cD 分別為置換劑在固定相和流動相中的濃度，qD/cD 是直線OD的斜率，稱之為操作線(operating line)。當操作線的斜率小于被分離組分等溫線的起始斜率，樣品才能進行置換展開，zui終形成如圖l(中的置換序列，這是在理想的情況下(假定無軸向擴散及二次化學(xué)平衡)獲得的置換色譜圖。每一組分形成矩形的平臺(Plateau)洗脫峰，相鄰各組分的平臺洗脫峰組成了一個臺階
狀的色譜圖。此時，樣品中不同的組分以置換劑的速度前進，即達到等速狀態(tài)(isobathic conditions)：
uD＝u2； u3＝u4
式中u2、u3、u4 指被置換的三組分的速度
