習(xí)慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個或多個個體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便屬于同一克隆。細(xì)胞學(xué)上，克隆是指由同一個祖細(xì)胞（progenitor cell）分裂而來的具有同一遺傳背景的子細(xì)胞群體。分子生物學(xué)上，把將外源DNA插入具有自主復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以自主復(fù)制和*保存的過程叫做分子克隆。
基因定位克隆或圖位克?。╩ap-based cloning）是用于分離其編碼產(chǎn)物尚不知道的目的基因的一種有效的方法。具體的步驟是先將目的基因，亦即目的基因的突變定位到染色體上，并在目的基因的兩側(cè)確定一對緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記；接著利用zui緊密連鎖的一對兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個分子標(biāo)記之間的含目的基因的特定的基因組片段克隆并分離出來；zui后是根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力從此克隆中鑒定出目的基因。成功地應(yīng)用基因定位克隆技術(shù)分離目的基因的一個必要條件是，以酵母人工染色體YAC（yeast artificial chromosome）為載體構(gòu)建含有大片段DNA的YAC庫。另一個必要的條件是要有可用的同目的的基因緊密連鎖的DNA探針。
酵母人工染色體（yeast artificial chromosome。YAC）載體可以克隆數(shù)百kb的大分子量的dna片段。YAC載體包括如下的組成部分：
① 一段來自酵母染色體的著絲粒序列；
② 一段控制酵母DNA復(fù)制的自主復(fù)制序列（autonomously replicatimg sequence，ARS）；
③一對酵母的端粒序列，在有的YAC載體中（例如pYAC4），這對端粒序列來自四膜（Tetrahymena）染色體；
④選擇記號；
⑤克隆位點(diǎn)。
YAC載體能夠如同染色體一樣在酵母細(xì)胞中正常地復(fù)制，并可以克隆大片段的外DNA，其大小至少可相當(dāng)于zui大的酵母染色體。應(yīng)用酵母人工染色體構(gòu)建真核基因組YAC庫的基本過程如下：首先選用核酸內(nèi)切限制酶EcoRI和BamHI對YAC載體pYAC4作雙酶消化，結(jié)果兩個端粒序列之間的片段便被移走，產(chǎn)生出具有EcoRI粘性末端的兩條臂分子。在每一條臂分子中都帶有一段端粒序列和一個選擇記號。同時再選用一種切割位點(diǎn)的核酸內(nèi)切限制酶，對高分子量的真核基因組DNA作局部消化。
反應(yīng)物通過脈沖電場凝膠電泳或密度離心除去分子量小于200kb的DNA片段，收集剩余部分的大分子量的DNA片段，純化后與YAC臂連接?；蛘呤侵苯訌碾娪灸z中切出含有所需分子量范圍的DNA片段的膠塊，從中提取DNA，并與YAC臂連接。然后再經(jīng)過一次脈沖電場凝膠電泳，把含有插入序列的YAC載體分離出來，并轉(zhuǎn)化給已經(jīng)去掉了細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞，即原生質(zhì)球。應(yīng)用存在于兩臂分子上的選擇基因（selectable genes），篩選含有YAC兩臂的酵母克隆。
一、RFLP分子標(biāo)記
所謂RFLP，即DNA限制片段長度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切限制酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)生出來的DNA片段在長度上的簡單變化。由于核酸內(nèi)切限制酶是以一種序列特異的方式切割DNA分子，來自一個完整的純合子個體（所有的基因及DNA序列）的每一種同源的DNA分子，都會在同樣的位點(diǎn)被準(zhǔn)確地切割。
從不同的生態(tài)型（ecotype）或不同的地理隔離群（geographical isolate）植株分離的總DNA中，同源DNA分子通常會表現(xiàn)出序列的趨異性（divergence），形成RFLP。這些RFLP是由于DNA序列上的特定變化（突變）引起的，因此它們也能夠像其他任何遺傳標(biāo)記一樣進(jìn)行定位，成為一種十分有用的分子標(biāo)記。
RFLP作圖的原理與步驟以擬南芥菜為例，簡述RFLP作圖的基本原理與步驟。將實(shí)驗(yàn)的條件限定為：兩個不同的擬南芥菜生態(tài)型，即Columbia生態(tài)型和Niederzenz生態(tài)型；兩個雜交探針，即基因A和基因B；一種核酸內(nèi)切限制酶EcoRI。從這兩個不同生態(tài)型的擬南芥菜提取的兩份總DNA，經(jīng)過EcoRI限制酶的切割和瓊脂糖凝膠電泳分部分離之后，作Southern轉(zhuǎn)移，并分別同放射性標(biāo)記的探針基因A和基因B雜交。
在圖中可以看到，兩親本生態(tài)型的DNA，同兩種探針雜交的結(jié)果都呈現(xiàn)出多態(tài)性現(xiàn)象，這說明在這兩個生態(tài)型的不同大小的DNA限制片段上，都存在著基因A和基因B的序列。F1代是雜合子，正如我們預(yù)期的情況一樣，它含有兩親本的限制片段。由這些F1代植株自花授粉所產(chǎn)生的F2代植株中，也會出現(xiàn)這種預(yù)期的1：2：1的分離模式。這兩個基因是獨(dú)立分配還是連鎖分配，會表現(xiàn)出非常不同的結(jié)果。
目前還可用其他分子標(biāo)記如SSLP和CAPS等進(jìn)行分子作圖。
二、染色體步移
染色體步移的起點(diǎn)是具有一個與待分離的目的基因盡可能靠近的已經(jīng)鑒定的分子標(biāo)記。這種標(biāo)記可以是RFLP，也可以是已知的基因克隆。
先構(gòu)建起點(diǎn)RFLP標(biāo)記克隆的限制圖，并把其中zui靠近目的基因的限制片段亞克隆出來。此限制片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針，從基因組文庫中篩選與起點(diǎn)克隆具有重疊序列的新克隆（稱之為一步克?。?。重復(fù)進(jìn)行上述的各個步驟。構(gòu)建一步克隆的限制圖，亞克隆其中zui靠近目的基因的限制片段，該片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針從基因組文庫中篩選與一步克隆具有重復(fù)序列的新克隆（稱之為二步克?。Ｈ绱酥貜?fù)進(jìn)行多次，每得到一個新的克隆都更接近目的基因一步，直至zui后獲得了目的基因的克隆。由于這種技術(shù)是通過逐一克隆來自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列，而慢慢靠近目的基因，因此
