細(xì)胞融合(cell fusion)或細(xì)胞雜交(cell hybridization)是指真核細(xì)胞通過介導(dǎo)和培養(yǎng),兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程。人工的細(xì)胞融合開始于20世紀(jì)50年代, 60年代到70代作為一門新興的技術(shù), 發(fā)展非常快, 應(yīng)用范圍也極為廣泛, 除了同種類細(xì)胞間可以融合, 種間遠(yuǎn)緣細(xì)胞也能融合, 細(xì)胞與組織不同, 不排斥異類、異種細(xì)胞, 動(dòng)物細(xì)胞如此,植物細(xì)胞也是如此?;蛐拖嗤募?xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體(homokaryon);來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體(heterokaryon)。
目前, 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有三種:病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和電激(Zimermann, 1980s)。副粘病毒科的病毒,如副流感病毒(Sendai virus)和新城雞瘟病毒,在其被膜中目前發(fā)現(xiàn)了兩種糖蛋白。較大的一種具有粘附細(xì)胞和凝血的作用;較小的一種可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合, 也可誘導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞融合,稱為融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合即是利用病毒的這一特性, 使用時(shí)先用紫外線將病毒滅活, 稀釋到一定濃度加入到細(xì)胞懸液中, 誘導(dǎo)細(xì)胞融合。但病毒介導(dǎo)細(xì)胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖與滅活,操作繁瑣,如滅活不*則易對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成傷害,因此現(xiàn)在一般不使用此方法。后兩種方法則是利用化學(xué)和物理手段,暫時(shí)使質(zhì)膜脂類分子的有序排列發(fā)生改變,待去掉作用因素之后,質(zhì)膜恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu),在恢復(fù)過程中便有可誘導(dǎo)相接觸的細(xì)胞發(fā)生融合??傊?,這3種方法都是在相互接觸的兩細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)過程中融合的。
細(xì)胞融合不僅可用于生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究,而且在生產(chǎn)實(shí)踐上還有重要的應(yīng)用價(jià)值,如目前在單克隆抗體的制備, 核質(zhì)關(guān)系, 體細(xì)胞的遺傳和發(fā)育, 新品種的培養(yǎng), 免疫作用, 疾病的治療和性狀的改良, 潛伏病毒的研究等,已取得了顯著的成績(jī)。
1.實(shí) 驗(yàn) 目 的
1.1. 通過PEG介導(dǎo)的雞血細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn), 對(duì)體細(xì)胞融合有一個(gè)清楚的概念
1.2. 并初步掌握利用PEG介導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)
2.實(shí) 驗(yàn) 原 理
利用PEG介導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合,其實(shí)驗(yàn)原理到目前為止還沒有*定論。學(xué)者們一般認(rèn)為,PEG改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu),使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排,再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用,引起相臨的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起, 使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通, 從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。
利用PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合, 其融合效果受以下幾種因素的影響。1. PEG的分子量與濃度: 細(xì)胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比;但PEG的分子量越大、濃度越高, 對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者,在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的PEG分子量一般為1000~4000,濃度一般為40~60%。2. PEG的pH值: 經(jīng)驗(yàn)證,PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果。3. PEG的處理時(shí)間: 處理時(shí)間越長(zhǎng),融合效果越好, 但對(duì)細(xì)胞的毒害也就越大。故一般將處理時(shí)間限制在1分鐘之內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞融合后無需繼續(xù)培養(yǎng), 故處理時(shí)間可適當(dāng)放寬至數(shù)分鐘。4. 融合時(shí)的溫度: 由于生物膜膜的流動(dòng)性與溫度成正比,故細(xì)胞的融合效果也與溫度成正比。因此,為了獲得更好的融合效果, 在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度。對(duì)于哺乳動(dòng)物的細(xì), 一般采用的溫度為38~40℃。
本實(shí)驗(yàn)所用材料為雞的血細(xì)胞,這是因?yàn)? 1. 雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核,便于對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行鑒別;2. 實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得。細(xì)胞融合與否,可通過觀察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來進(jìn)行鑒別。細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)核,定為未融合細(xì)胞;有二至多個(gè)核,定為融合細(xì)胞。