原核微生物基因重組主要可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等途徑，但有些微生物不適于采用這些途徑，從而使育種工作受到一定的限制。1978 年第三屆工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上，有人提出微生物細(xì)胞原生質(zhì)體融合這一新的基因重組手段。由于它具有許多特殊優(yōu)點(diǎn)，所以，目前已為國(guó)內(nèi)外微生物育種工作所廣泛研究和應(yīng)用。
(一) 原生質(zhì)體融合的優(yōu)點(diǎn)
(1) 克服種屬間雜交的“不育性”，可以進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交。由于用酶解除去細(xì)胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同種屬間的微生物，皆可發(fā)生原生質(zhì)體融合，產(chǎn)生重組子。
(2) 基因重組頻率高，重組類型多。原生質(zhì)體融合時(shí)，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使細(xì)胞相互聚集，可以提高基因重組率。原生質(zhì)體融合后，兩個(gè)親株的整套基因組 (包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì))相互接觸，發(fā)生多位點(diǎn)的交換，從而產(chǎn)生各種各樣的基因組合，獲得多種類型的重組子。
(3) 可將由其他育種方法獲得的優(yōu)良性狀，經(jīng)原生質(zhì)體融合而組合到一個(gè)菌株中。
(4) 存在著兩個(gè)以上親株同時(shí)參與融合，可形成多種性狀的融合子。
(二) 原生質(zhì)體融合步驟
(1) 選擇親本 選擇兩個(gè)具有育種價(jià)值并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的菌株作為親本。
(2) 制備原生質(zhì)體 經(jīng)除去細(xì)胞壁，釋放出原生質(zhì)體，并置高滲液中維持其穩(wěn)定。
(3) 促融合 聚乙二醇加入到原生質(zhì)體以促進(jìn)融合。聚乙二醇為一種表面活性劑，能強(qiáng)制性的促進(jìn)原生質(zhì)體融合。在有Ca2+ 、Mg2+離子存在時(shí)，更能促進(jìn)融合。
(4) 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體已失去細(xì)胞壁，雖有生物活性，但在普通培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，必須涂布在再生培養(yǎng)基上，使之再生。
(5) 檢出融合子 利用選擇培養(yǎng)基上的遺傳標(biāo)記，確定是否為融合子。
(6) 融合子篩選 產(chǎn)生的融合子中可能有雜合雙倍體和單倍重組體不同的類型，前者性能不穩(wěn)定，要選出性能穩(wěn)定的單倍重組體，反復(fù)篩選出生產(chǎn)性能良好的融合子。
(三) 原生質(zhì)體再生率和融合率計(jì)算

三、實(shí)驗(yàn)材料
(一) 菌種
枯草芽孢桿菌T4412 ade- his-、枯草芽孢桿菌TT2 ade-pro-
(二) 培養(yǎng)基(見附錄)
(1) *培養(yǎng)基(CM，液體)；
(2) *培養(yǎng)基(CM，固體) 液體培養(yǎng)基中加入2.0%瓊脂；
(3) 基本培養(yǎng)基(MM)；
(4) 補(bǔ)充基本培養(yǎng)基(SM) 在基本培養(yǎng)基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的純化瓊脂，75 Pa 滅菌20min；
(5) 再生補(bǔ)充基本培養(yǎng)基(SMR) 在補(bǔ)充基本培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％純化瓊脂作上層平板，2.0％純化瓊脂作底層平板、75 Pa 滅菌20 min。
(6) 酪蛋白培養(yǎng)基(測(cè)蛋白酶活性用)。
(三) 緩沖液
(1) 0.1mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液。
(2) 高滲緩沖液：于上述緩沖液中加入0.8 mol/L 。
(四) 原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM)
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 順丁烯二酸，調(diào)pH 6.5。
(五) 促融合劑
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六) 液
酶粉酶活為4000 u/g，用SMM 溶液配制，終濃度為2 mg/mL，過(guò)濾除菌備用。
(七)器皿
培養(yǎng)皿、移液管、試管、容量瓶、錐形瓶、燒杯、離心管、吸管、顯微鏡、臺(tái)式離心機(jī)、721 比
色計(jì)、細(xì)菌過(guò)濾器。