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怎么使用胰島素elisa試劑盒產(chǎn)品
最近更新時間：2013-1-5
提 供 商：上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司資料大小：38.5KB
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1、實(shí)驗(yàn)原理
DRG公司的胰島素酶免實(shí)驗(yàn)是一種基于夾心法原理的固相酶聯(lián)免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）,反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合胰島素分子上*抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性胰島素的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種*標(biāo)記的抗胰島素抗體。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。在第二次溫育時，鏈親和素過氧酶復(fù)合物結(jié)合到*化抗胰島素抗體上，過氧酶復(fù)合物的結(jié)合量與樣品中胰島素的濃度成正比。加入底物液后，所顯示的顏色強(qiáng)度與病人樣品中胰島素的濃度成正比。
2、試劑盒成分
1）微孔板：12×8，96孔，包被抗胰島素的單克隆抗體。
2）零標(biāo)準(zhǔn)品：1支，3ml，即用，0μIU/ml。
3）標(biāo)準(zhǔn)品1－5：5支，1ml，即用，6.25;12.5;25;50;100μlU/ml。
4）酶聯(lián)物：1支，5ml，即用，*化的鼠單克隆抗體。
5）酶復(fù)合物：1支，7ml，即用，辣根過氧化物-鏈親和素復(fù)合物。
6）TMB底物液：1支14ml即用。
7）終止液：1支14ml即用包含0.5M硫酸,請勿接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。
8）洗滌液：1瓶，30ml，40倍濃縮，見試劑準(zhǔn)備。
注意：用樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品視需要而定。
3、實(shí)驗(yàn)所需材料（但試劑盒不提供）
1）酶標(biāo)儀
2）標(biāo)準(zhǔn)移液器
3）吸水紙
4）蒸餾水
4、試劑的儲存與穩(wěn)定性
所有的未開啟的試劑在2－8℃下儲存至保質(zhì)期，不要使用過期的試劑。所有開啟的試劑應(yīng)在2－8℃下儲存。一旦打開微孔板的包裝，需將其重新密封。
5、樣品的準(zhǔn)備
將所有的試劑和所需要的板條在使用前平衡至室溫。
洗滌液：用1170ml的蒸餾水稀釋30ml濃縮的洗滌液，zui終得到的容積為1200ml，稀釋好的洗滌液在室溫下可穩(wěn)定存放兩個星期。
6、樣品的收集
此ELISA試劑盒可使用血清也可使用（只有肝素或檸檬酸鹽抗凝的血漿）血漿作為樣品。
不能使用明顯溶血﹑黃疸和脂血的樣品。
血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下離心分離血清。
血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管，采集后立即離心分離。
7、樣品的儲存：
樣品蓋好蓋子后，可在實(shí)驗(yàn)前2-8℃下儲存5天，要更長時間儲存，應(yīng)在-20℃下凍存。在開始實(shí)驗(yàn)前應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品。
8、樣品的稀釋：
在*次實(shí)驗(yàn)中，要是樣品的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品，則樣品應(yīng)用按實(shí)驗(yàn)步驟所描述的10倍或100倍稀釋。在計(jì)算濃度時需乘以此稀釋度。
例子：
a）按1：10稀釋：10μL的血清+90μL的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分搖勻）。
b）按1：100釋稀：10μL按a）稀釋的血清+90μL的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分搖勻）
9、實(shí)驗(yàn)步驟
所有的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有微孔的檢測條件都一樣。
1）將所需數(shù)目的板條置于板架上。。
2）用一次性吸嘴將標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和樣品分別25μL加入相應(yīng)的檢測孔中。
3）每孔加入25μL的酶聯(lián)物。
4）充分混合10秒，在此步驟中充分混合非常重要。
5）室溫下溫育30分鐘。
6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔加入400μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和度。
7）每孔加入50μL的酶復(fù)合物。
8）在室溫下溫育30分鐘。
9）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔加入400μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。
10）每孔加入50μL的底物液。
11）在室溫下溫育15分鐘。
12）每孔加入50μL的終止液終止反應(yīng)。
13）在加終止液后10分鐘內(nèi)于450±10nm處讀取OD值。
10、計(jì)算結(jié)果：
1）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和病人樣品的平均吸光度。
2）以吸光率為Y軸，濃度為X軸，按照從標(biāo)準(zhǔn)品中獲得的平均吸光率和其相對應(yīng)的濃度值，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3）利用樣品的平均吸光率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出其相應(yīng)的濃度值，
4）自動方法：使用計(jì)算機(jī)三次方模式﹑四參數(shù)模式或雙對數(shù)函數(shù)的計(jì)算機(jī)程序可得到結(jié)果。
5）樣品的濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接獲取。樣品的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的濃度則需進(jìn)一步稀釋。在計(jì)算濃度的時候，要乘以樣品的稀釋倍數(shù)。
下面是胰島素ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的典型例子。
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | 吸光率（450nm） |
| 零標(biāo)準(zhǔn)品（0 μIU/ml） | 0.03 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品1（6.25 μIU/ml） | 0.07 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品2（12.5 μIU/ml） | 0.14 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品3（25 μIU/ml） | 0.35 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品4（50 μIU/ml） | 0.88 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品5（100 μIU/ml） | 2.05 |
參考值：
建議各實(shí)驗(yàn)室建立自己的正常值與非正常值。
在一明顯正常成年人的研究中，用DRG公司的胰島素ELISA試劑盒進(jìn)行檢測得到如下數(shù)值：2-25μIU/ml
產(chǎn)品描述：
胰島素是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的主要激素，它由朗格漢氏小島的β細(xì)胞合成分泌，并以前胰島素的前體形式存在，前胰島素可加工形成C肽和胰島素。這兩種激素都以等量形式分泌到門脈循環(huán)中。成熟的胰島素分子由兩條多肽鏈組成，A鏈和B鏈（分別21個和30個氨基酸）。這兩條鏈通過鍵內(nèi)二硫鍵而連接到一起。胰島素的分泌主要受血漿葡萄糖濃度的影響，這種激素有一系列重要的代謝功能。它的主要功能是通過葡萄糖的運(yùn)送來控制外周組織中葡萄糖的攝取和利用。胰島素和其它低血糖激素的作用（如抑制肝糖原的異生和糖原分解）可被高血糖激素（胰高血糖素，腎上腺素，生長激素和*）的作用中和掉。在胰島素依賴性的糖尿?。↖DDM）和其它疾病例如垂體機(jī)能減退疾病中,胰島素的濃度會明顯降低。在非胰島素依賴性的糖尿病患者、肥胖患者、胰島素瘤患者和一些內(nèi)分泌功能紊亂（如庫欣綜合癥和支端肥大癥）患者的體內(nèi)，其胰島素的水平會上升。