美國Nalgene程序降溫盒

細胞凍存有兩種方法：傳統(tǒng)的方法是利用冷存管處于4℃、 -20℃、 -80℃保存，程序降溫方法是利用程序降溫盒設(shè)定程序由室溫降低至-80℃，zui后再放置到液氮槽中長期保存。程序降溫盒的使用注意事項如下：

美國Nalgene程序降溫盒

實驗室雖然有程序降溫凍存盒，但怎么使用一直都搞不明白，我覺得是不是應(yīng)該把程序降溫凍存盒先從-80度移到室溫放一段時間(細胞剛開始還沒凍的時候就是室溫)，然后把細胞放進去，再一起移到-80度，這樣才能實現(xiàn)程序降溫呢? 時間使用長了，感覺里面的液體是不是異丙醇啊，使用時間長了會不會揮發(fā)或變質(zhì)什么的，要不要添加或維護一下呢，還有有一只降溫盒因不小心給傾斜讓液體流出了部分，要補充嗎?

經(jīng)驗1：凍存盒外表面有刻度的吧，異丙醇液面要高于zui底線。4 a. C* D8 Y& P9 A, y

凍存盒肯定是先放在室溫，然后放進去細胞，置于-80，利用異丙醇實現(xiàn)梯度降溫啊。) ~0 O( O# Q* }: w# D" R' _

根據(jù)論壇里的討論，異丙醇使用過一段時間后是要更換的，但是我一直沒換過，也沒發(fā)現(xiàn)很大問題。

經(jīng)驗2：我們實驗室凍存盒平時放4度，需要凍細胞時直接拿出來用就可以了。第二天轉(zhuǎn)移至液氮，貴重的細胞盡快轉(zhuǎn)移，不然會影響復(fù)蘇成活率的。一般是用5次就更換一下異丙醇?，F(xiàn)在也有一些商品化凍存液可以直接丟進-80的，很方便，效果也不錯的。

經(jīng)驗3：異丙醇的量是要保證的，不能低于表明的線，否則不能起到很好的程序性降溫作用，我們是在4度放置，放了細胞后立馬放到-80度冰箱，第二天再轉(zhuǎn)移到液氮，效果很不錯。異丙醇熔點：-87.9度的色透明具有乙醇氣味的可燃性有毒液體。注意了有可燃性!急性毒性：口服- 大鼠 LD50: 5840 毫克/ 公斤; 口服- 小鼠 LC50: 3600 毫克/ 公斤。刺激數(shù)據(jù)：眼睛- 兔子100 毫克/ !請注意清理!

美國Nalgene程序降溫盒

經(jīng)驗4：應(yīng)該不可以把凍存盒放4°的，因為梯度降溫的起始點是室溫20°左右，所以從-80℃拿出來的凍存盒應(yīng)該現(xiàn)在室溫靜置一段時間待其恢復(fù)到室溫再使用。而其中的異丙醇應(yīng)使用6~7此后更換一次，而且保證液體量達到刻度線，否則降溫效果會受到影響。

經(jīng)驗5：凍存盒里的異丙醇一般是250ml，低于刻度了要加上，理論上是5次以后更換異丙醇，但是異丙醇對環(huán)境有害，我們可以多用幾次，只是少了的時候要加滿。還有凍存液里面的DMSO對細胞有毒性，尤其是室溫的時候，所以凍存盒和凍存液先放4°，等把細胞用凍存液重懸好了放在凍存盒里，還放回4°，等到出細胞間的時候再拿到-80°里面保存。過夜再轉(zhuǎn)入液氮。

程序降溫盒這個梯度降溫可大大提高細胞凍存的存活率，由于程序降溫盒內(nèi)存在100%濃度的異丙醇和泡沫內(nèi)襯，因此程序降溫盒也可以用于細胞復(fù)蘇。

1,remove high-density polyethylene tube holder and foam insert from polycarbonate unit .do not discard foam insert.
2,add 100% isopropyl alcohol to the fill line on the container. do not overfill.
3,carefully replace foam insert and tube holder.
4,place tubes containing sample into holes in tube holder.
5,place unit in bottom of -70°C to- 80°C mechanical freezer. leave undisturbed for a mininum of 4 hours.
6,remove frozen tubes from unit and place in a permanent,long-term storage freezer.
do not store full jar on its side. store at room temperature when not in use replace alcohol every fifth use. clean with non-abrasive,non-alkaline detergent such as .the tube holder floats with tubes in place an can be used as a floating rack when thawing samples.