Na~+-K~+-ATP酶活性比色法定量檢測試劑盒說明書

主要用途  

ATP酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是生物膜上的一種蛋白酶，機體在缺氧及等狀態(tài)下，ATP酶受到損傷，活力下降。ATP酶活力的大小是各種細(xì)胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標(biāo)。本測試盒可測鈉鉀—ATP酶、鈣鎂—ATP酶的活性。樣品為各種組織及紅細(xì)胞等，本法的zui大特點是樣品前處理不需要高速離心機，方法簡便、快速。

產(chǎn)品內(nèi)容  

緩沖液（Reagent A）                      6毫升  

反應(yīng)液（Reagent B）                      6毫升  

底物液（Reagent C）                      6 毫升

陰性液（Reagent D）                      6毫升

標(biāo)準(zhǔn)品（reagent E）                       6 微升 

產(chǎn)品說明書                                1 份  

保存方式  

保存反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在 4℃  冰箱里；底物液（Reagent C）避免光照，有效保證 6 月   

用戶自備  

1.5 毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備   

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器   

分光光度儀：用于比色分析  

酶標(biāo)儀：用于微量樣品比色分析  

實驗步驟      

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）  置入冰槽里融化。底物液（Reagent C）避免光照。然后進(jìn)行下列操作。   

• 樣品準(zhǔn)備       

選擇一：血漿樣品   

1． 準(zhǔn)備好 ACD 抗凝管（注意：避免使用肝素或 EDTA  抗凝管）  

2． 抽取 2 毫升血液，置于抗凝管里   

3． 放進(jìn) 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 5000 g

4． 小心移取上層黃色液體到新的 1.5 毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）   

5． 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存   

6． （選擇步驟）移取50 微升進(jìn)行蛋白定量測定

選擇二：血清樣品   

1． 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲存管    

2． 抽取 2 毫升血液，置于儲存管里  

3． 室溫下，靜置 30 分鐘，直至血液凝結(jié)   

4． 放進(jìn) 4℃微型臺式離心機離心 15 分鐘，速度為 5000 g

5． 小心移取上層黃色液體到新的 1.5 毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）   

6． 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存   

7． （選擇步驟）移取 50 微升進(jìn)行蛋白定量測定

選擇三：組織樣本

準(zhǔn)確稱取組織重量，按照重量（g）：體積（ml）=1:9的比例，加入9倍的是PBS或者生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，2500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，去上清液待測。

二、 測定準(zhǔn)備     

1. 準(zhǔn)備好上述待測樣品，置于冰槽里   

2. 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 37℃）：波長 440nm

三、樣本測定

1． 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔   

2． 分別移取 50微升緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中   

3． 設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品孔(加入50微升標(biāo)準(zhǔn)品），樣本孔(加入50微升樣本)陰性液孔(加入 50微升陰性液（Reagent D）

4． 分別加入50微升反應(yīng)液（Reagent B）  

5． 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板   

6． 在 37℃溫度下孵育 2 分鐘   

7． 放進(jìn)酶標(biāo)儀，置零   

8． 取出酶標(biāo)板，分別加入 50微升底物液（Reagent C）  

9． 輕輕搖動酶標(biāo)板   

10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測，包括（0 分鐘初始讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)）   

四，樣本計算

樣本活性=樣本OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值*標(biāo)品濃度